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乌饭树叶色素的提取及性质分析
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乌饭树叶色素的提取及性质分析
官方公共微信乌饭树叶中黄酮等有效成分分析及抗肿瘤作用研究--《福建农林大学》2008年博士论文
乌饭树叶中黄酮等有效成分分析及抗肿瘤作用研究
【摘要】：
乌饭树(Vaccinium bracteatum Thunb.)为杜鹃花科(Erioaoeae)越桔属(Vaccinium)植物,又名南烛、乌饭子、染菽等,是一种药用植物。国外将乌饭树叶有效成分应用于食品添加剂与眼疾治疗物;我国中医认为,乌饭树嫩叶取汁制成的乌饭药食兼具有轻身明目,黑发驻颜,延年益寿的功效。本研究主要着眼于乌饭树叶黄酮等有效成分分析及抗肿瘤作用的研究,对比不同干燥方法对乌饭树叶有效成分、主要营养成分及外观品质的影响,利用响应面分析法优化乌饭树叶黄酮的提取条件,探讨超临界CO_2萃取乌饭树叶黄酮的参数条件,利用动物试验阐明乌饭树叶乙醇提取物的急性毒性及其抗肿瘤作用,结合高速逆流色谱(HSCCC)与HPLC技术实现对抗肿瘤活性成分——槲皮素的分离。主要结果如下:
1.采用热风烘干、自然晾干、真空低压干燥、真空冷冻干燥4种方法处理乌饭树叶新鲜原料,对比不同处理方法对乌饭树叶有效成分(黄酮、黄酮苷、多酚、单宁)、主要营养成分(可溶性蛋白质、可溶性糖、粗脂肪)及外观品质的影响,分析了乌饭树叶不同生长期的有效成分及主要营养成分的变化趋势,以及黄酮类物质的生长部位分布规律与地区性差异。结果表明,真空冷冻干燥对乌饭树叶有效成分、主要营养成分及外观品质的影响最小;从生长时期来看,秋季采收的乌饭树叶除多酚含量下降2%外,其他成分(可溶性蛋白质、可溶性糖、粗脂肪、黄酮、黄酮苷、单宁)的含量都较春夏两季的要高。不同产地、不同采摘时间的乌饭树叶的黄酮苷含量差异明显(p＜0.05),乌饭树叶的枝条含有少量的黄酮苷,试验中原料含水率在0.1～0.5%,采摘时间以6～9月为宜,原料产地选择福州鼓岭。
2.从经济安全的角度出发,选择乙醇为提取溶剂,采用单因素试验、部分析因试验以及中心组合试验、响应面分析法对有机溶剂浸渍提取乌饭树叶黄酮进行了深入研究,分析乌饭树叶乙醇提取物的主要成分及乙醇提取物活性成分的热稳定性。试验结果表明:乙醇浓度和提取温度是影响乌饭树叶黄酮提取量的关键因子,乌饭树叶黄酮的最佳工艺条件为:提取前浸泡60 min,液料比50:1,乙醇浓度86.7%,提取温度61℃,提取时间2h,在此条件下一次提取率可达68.12%。乌饭树叶乙醇提取物的主要成分中黄酮类物质所占比重较大(20.76%)。此外,提取物中还含有8.82%的单宁。所采用的提取温度(61℃)对乙醇提取物中黄酮类成分——槲皮素没有影响,较高提取温度(70℃)对槲皮素有破坏作用。
3.采用单因素及正交试验寻找超临界CO_2萃取乌饭树叶黄酮的最佳条件,首次探讨了夹带剂、夹带剂浓度及用量对乌饭树叶黄酮提取量的影响,并对比超临界萃取法与有机溶剂浸渍法的黄酮提取率及提取物的成分。试验结果表明,最佳的超临界CO_2提取条件为:萃取压力16MPa,萃取时间1.5h,萃取温度50℃,夹带剂乙醇浓度75%,CO_2流量20 kg/h,夹带剂添加量5mL/g。将夹带剂添加到乌饭树叶的超临界CO_2萃取中,在一定程度上提高了黄酮的提取量,但并没有将大部分的黄酮都提取出来。HPLC分析表明超临界萃取法较有机溶剂浸提法可以提取更多的化学成分,但黄酮提取率与有机溶剂浸提法相比还差11%左右。
4.以乌饭树叶乙醇提取物(主要含黄酮类化合物)进行小鼠急性毒性试验。研究结果表明,采用DAS ver1.0 Bliss法计算出的乌饭树叶乙醇提取物的LD_(50)为39.1g/kg,其95%可信限为36.8～41.6g/kg,未见急性毒副作用,该提取物临床应用安全。
5.以环磷酰胺(CTX)为阳性对照组,以生理盐水为阴性对照组,观察各剂量乙醇提取物对实体瘤(U14)和腹水癌(S180)的抑制作用。结果表明,高剂量的乙醇提取物能显著抑制小鼠宫颈癌细胞株(U14)的生长(p＜0.05),抑制率达28.76%,而中、低剂量的乙醇提取物对小鼠宫颈癌细胞株(U14)没有抑制作用。高、中和低剂量的乙醇提取物均不能抑制小鼠腹水癌(S180)的生长。
6.采用近年来备受关注的高速逆流色谱分离技术实现乌饭树叶乙醇提取物有效成分的分离纯化,并结合高效液相色谱技术鉴定分离物——槲皮素及其纯度。结果表明,经过薄层色谱初筛后得到氯仿-甲醇-水(4:3:2)和氯仿-甲醇-正丁醇-水(5:1:3:1)两个溶剂系统。氯仿-甲醇-水(4:3:2)溶剂系统对乙醇提取物分离效果较好,得到的馏分A的紫外-可见吸收光谱图与槲皮素标准品的相似,通过面积归一法计算其纯度达98.3%,而采用氯仿-甲醇-正丁醇-水(5:1:3:1)溶剂系统,收集得到馏分A属于混合物质,经高效液相色谱分离,得到两个主要成分1、2,其中含量较大的成分1与标准谱图对照,也证明是黄酮类物质——槲皮素。
【关键词】：
【学位授予单位】：福建农林大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2008【分类号】：R284.2【目录】：
Abstract12-15
第一章 绪论15-38
0 引言15-16
1 乌饭树研究进展16-28
1.1 营养成分研究16-20
1.1.1 乌饭树果实营养成分16-17
1.1.2 乌饭树叶营养成分17-20
1.2 有效成分研究20-24
1.2.1 乌饭树果色素及其理化性质研究20-21
1.2.2 乌饭树叶色素提取及理化性质的研究21-22
1.2.3 乌饭树黄酮类物质的研究22-24
1.3 乌饭树及其同属植物的药效研究24-27
1.3.1 抗疲劳及延缓衰老24
1.3.2 抗贫血及增强机体免疫力24
1.3.3 抗氧化作用24-25
1.3.4 抗癌防癌25
1.3.5 抗菌、抗病毒及抗炎作用25-26
1.3.6 改善视网膜功能26
1.3.7 治疗糖尿病作用26
1.3.8 镇咳作用26-27
1.3.9 其它健康作用27
1.4 乌饭树属资源利用及前景分析27-28
1.4.1 乌饭树叶冲泡饮品27-28
1.4.2 乌饭树叶提取物产品28
1.4.3 速食乌米饭28
2 超临界CO_2萃取技术提取中药植物黄酮研究展28-33
2.1 概述28-30
2.2 超临界流体萃取的影响因素30-33
2.2.1 流体30
2.2.2 夹带剂30-31
2.2.3 原料含水量31-32
2.2.4 萃取压力32
2.2.5 萃取温度32-33
2.2.6 多因素协同效应33
3 高速逆流色谱分离植物黄酮研究进展33-35
3.1 起源与发展33
3.2 工作原理33
3.3 种类与优点33-34
3.4 分离黄酮化合物的研究进展34-35
4 响应面分析法及其应用35-36
4.1 分析角度与应用优势35
4.2 响应面分析法优化提取条件的研究35-36
5 乌饭树研究存在问题36
6 本论文的研究内容及立题意义36-38
6.1 本论文的研究内容36-37
6.2 立题意义37-38
第二章 乌饭树叶有效成分研究38-54
1 材料与方法38-45
1.1 材料38-39
1.1.1 原料38
1.1.2 药品与试剂38-39
1.1.3 仪器与设备39
1.2 干燥方法39
1.3 试验设计39-40
1.4 测定指标40-45
1.4.1 可溶性蛋白质40-41
1.4.2 可溶性糖41-42
1.4.3 粗脂肪42
1.4.4 水分42
1.4.5 黄酮42-43
1.4.6 黄酮苷43-44
1.4.7 多酚44
1.4.8 单宁44-45
1.5 数据处理45
2 结果与分析45-51
2.1 干燥方法式对乌饭树叶有效成分、主要营养成分与外观品质的影响45-49
2.2 不同生长期乌饭树叶有效成分与主要营养成分的变化49-50
2.3 不同部位、不同产地乌饭树叶黄酮苷含量比较50-51
3 讨论51-54
3.1 乌饭树叶有效成分及主要营养成分变化原因51-52
3.2 含水率52
3.3 采摘时间52
3.4 地区差异性52-54
第三章 响应面分析法优化乌饭树叶黄酮提取条件54-74
1 材料与方法54-57
1.1 材料54-55
1.1.1 原料54
1.1.2 药品与试剂54-55
1.1.3 仪器与设备55
1.2 提取方法55
1.3 试验设计55
1.4 分析方法55-56
1.4.1 黄酮55-56
1.4.2 黄酮苷56
1.4.3 单宁56
1.4.4 可溶性糖56
1.4.5 热稳定性56
1.5 数据处理56-57
2 结果与分析57-70
2.1 单因素试验与分析57-60
2.1.1 筛选提取溶剂57
2.1.2 确定液料比57
2.1.3 确定提取温度57-58
2.1.4 确定提取时间58-59
2.1.5 确定提取次数59
2.1.6 确定预浸泡时间59-60
2.2 析因试验设计和结果60-61
2.3 最陡爬坡试验及结果61-62
2.4 响应面分析法(RSM)优化工艺条件62-65
2.5 乙醇粗提物主成分分析65
2.6 乙醇粗提物活性成分热稳定性分析65-70
3 讨论70-74
3.1 影响因子与黄酮提取量的关系70-72
3.1.1 提取溶剂70
3.1.2 液料比70-71
3.1.3 提取温度71
3.1.4 提取时间71-72
3.2 选择全面分析法——(RSA)优化提取条件72
3.3 乙醇粗提物活性成分72-73
3.4 黄酮类化合物——槲皮素的热稳定性分析73-74
第四章 超临界CO_2萃取乌饭树叶黄酮的研究74-89
1 材料与方法74-76
1.1 材料74-75
1.1.1 原料74
1.1.2 药品与试剂74-75
1.1.3 仪器与设备75
1.2 提取方法75
1.2.1 超临界CO_2萃取75
1.2.2 有机溶剂浸提75
1.3 试验设计75-76
1.4 分析方法76
1.4.1 黄酮76
1.4.2 HPLC分析76
1.5 数据处理76
2 结果与分析76-87
2.1 单因素试验与分析76-81
2.1.1 确定萃取压力76-77
2.1.2 确定CO_2流量77-78
2.1.3 确定萃取时间78
2.1.4 筛选夹带剂78
2.1.5 确定萃取温度78-79
2.1.6 确定夹带剂浓度和添加量79-81
2.2 正交试验设计与结果81-83
2.3 验证试验83
2.4 超临界提取物与有机溶剂浸提物的HPLC差异分析83-86
2.5 超临界CO_2萃取法与有机溶剂浸提法效果对比86-87
3 讨论87-89
3.1 影响因子与黄酮提取量之间的关系87-88
3.1.1 萃取压力87
3.1.2 夹带剂及其浓度87
3.1.3 CO_2流量87-88
3.1.4 萃取时间88
3.1.5 萃取温度88
3.2 超临界提取乌饭树叶效果分析88-89
第五章 乌饭树叶乙醇提取物急性毒性及抗肿瘤作用的研究89-96
1 材料与方法89-92
1.1 材料89-90
1.1.1 原料89
1.1.2 药品制备89
1.1.3 试验动物89
1.1.4 瘤株89-90
1.1.5 仪器与设备90
1.2 方法90-91
1.2.1 急性毒性试验90-91
1.2.2 抗肿瘤试验91
1.3 数据处理91-92
2 结果与分析92-94
2.1 探索剂量范围92
2.2 最大死亡剂量的确定92
2.3 LD_(50)的确定92
2.4 小鼠移植性宫颈癌实体瘤(U14)试验结果92-93
2.5 小鼠移植性腹水型肝癌(S180)试验结果93-94
3 讨论94-96
3.1 实体瘤与腹水瘤抑制效果分析94-95
3.2 乙醇提取物活性物质与抗肿瘤的关系95-96
第六章 应用高速逆流色谱分离乌饭树叶有效成分96-108
1 材料与方法97-100
1.1 材料97-98
1.1.1 原料97
1.1.2 溶液配制97
1.1.3 药品与试剂97-98
1.1.4 仪器与设备98
1.2 试验方法98-99
1.2.1 薄层色谱(TLC)鉴定98
1.2.2 高速逆流色谱分离98-99
1.3 分析方法99-100
1.3.1 定性鉴定99
1.3.2 HPLC分析99-100
1.4 数据处理100
2 结果与分析100-106
2.1 乌饭树叶提取物与槲皮素对照品的薄层层析对比100
2.2 溶剂系统初步选择100-101
2.3 最佳溶剂系统的筛选101
2.4 定性鉴定101-102
2.5 紫外-可见吸收光谱分析结果102-104
2.5.1 槲皮素标准品紫外-可见吸收光谱扫描102
2.5.2 溶剂系统(K)分离得到的馏分A的紫外-可见吸收光谱扫描102-104
2.6 高效液相色谱分离104-106
3 讨论106-108
3.1 溶剂系统对分离效果的影响106-107
3.2 分离物的定性分析107
3.3 制备标准物质107-108
第七章 结论与展望108-110
1 全文结论108-109
2 本研究存在的问题109
3 下一步要解决的问题109
4 展望109-110
参考文献110-121
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