棉蚜类异戊二烯通路两个关键酶基因的克隆与功能分析--《中国农业大学》2014年博士论文
棉蚜类异戊二烯通路两个关键酶基因的克隆与功能分析
【摘要】：棉蚜(Aphis gossypii Glover),属半翅目Hemiptera、蚜科Aphididae、蚜属Aphis,是一种世界性的农业害虫,主要通过刺吸植物汁液和传播病毒病对棉花、瓜果蔬菜等造成严重危害。类异戊二烯通路是棉蚜体内一个重要的代谢途径,此通路上的多种类异戊二烯代谢产物对棉蚜的生长发育、生理活动都有重要的作用,因此对此通路上的一些关键酶进行深入的分析和研究具有重要的意义。异戊二烯基焦磷酸合成酶(又称为异戊二烯基转移酶)就是这样一类关键酶,其催化产物是多种类异戊二烯化合物的前体物质。本研究对其中的两个关键酶——十聚异戊二烯焦磷酸合成酶(DPPS)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)的编码基因进行了克隆、重组表达和功能分析。
十聚异戊二烯焦磷酸合成酶(DPPS)属于长链异戊二烯基焦磷酸合成酶,是辅酶Q异戊二烯侧链合成过程中的关键酶。辅酶Q在生物体中发挥着重要的生理作用。长链异戊二烯基焦磷酸合成酶在细菌、酵母、植物和哺乳动物中已得到广泛研究,但在昆虫中研究得很少。本研究克隆了编码棉蚜十聚异戊二烯焦磷酸合成酶(AgDPPS)两个亚基的基因(AgDPPS1和AgDPPS2, GenBank登录号：KC431243和KC431244)。它们分别包含1230bp和1275bp的开放阅读框,编码409个和424个氨基酸。序列比对和系统进化分析表明,AgDPPS与人类的DPPS类似,是由两个异源亚基构成的。重组表达和体外的酶促分析结果表明,这两个亚基对该酶的催化活性是缺一不可的,形成的主要中间产物是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)。在大肠杆菌DH5α的体内表达分析表明,AgDPPS是棉蚜合成辅酶Q10的关键酶。我们的研究表明,AgDPPS的催化过程包含两个主要步骤,其催化过程以GGPP作为主要中间产物,以十聚异戊二烯焦磷酸(DPP)作为最终产物。我们的研究是昆虫中首次对合成辅酶Q10侧链的关键酶的研究。
牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)是短链异戊烯转移酶,其催化产物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)在蚜虫体内最重要的作用是蛋白质的异戊烯基化。这种修饰对于蛋白质在膜结构或胞质中的特异性定位、细胞骨架组装、细胞间信号传导有重要意义。GGPPS在植物、真细菌、古细菌、酵母和哺乳动物中已被广泛研究,但对昆虫中GGPPS的研究仍然非常少。本研究克隆了编码棉蚜牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(AgGGPPS)的基因(GenBank登录号KF220654),其具有930bp的开放阅读框,编码309个氨基酸,理论等电点是6.21。序列分析和系统进化分析表明,AgGGPPS的氨基酸序列包含所有异戊二烯基转移酶具有的富含天冬氨酸的保守区域,AgGGPPS作为昆虫的GGPPS被归类为Ⅲ型GGPPS.本研究对AgGGPPS的原核重组表达、亲和层析纯化以及体外酶活性的测定,发现了AgGGPPS能催化DMAPP、GPP或FPP作为烯丙基底物与IPP反应形成GGPP。虽然在不同的底物情况下AgGGPPS的酶活性有所不同,但与其他只接受FPP为烯丙基底物的Ⅲ型GGPPS是不同的。
本研究首次鉴定了棉蚜类异戊二烯通路两个关键酶,并对其生化特性进行了深入研究,所获得的结果有助于利用棉蚜类异戊二烯通路调控蚜虫的发育,从而为蚜虫的防控提供科学依据。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2014【分类号】：S435.622.1【目录】：
摘要3-4Abstract4-10第一章 绪论10-21 1.1 棉蚜简介10-12 1.2 类异戊二烯通路研究进展12-14 1.3 异戊烯基转移酶(IPPS)研究进展14-15 1.4 十聚异戊二烯焦磷酸合成酶(DPPS)研究进展15-17 1.5 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)研究进展17-19 1.6 本研究技术路线图19-20 1.7 本研究的目的及意义20-21第二章 棉蚜DPPS基因的克隆及分析21-39 2.1 材料与方法21-30
2.1.1 供试昆虫21
2.1.2 主要试剂21-22
2.1.3 主要仪器22-23
2.1.4 技术路线23
2.1.5 棉蚜DPPS1基因cDNA全长的克隆23-29
2.1.6 棉蚜DPPS2基因cDNA全长的克隆29-30
2.1.7 氨基酸序列比对及系统进化分析30 2.2 结果与分析30-38
2.2.1 棉蚜DPPS1基因cDNA全长序列的获得30-32
2.2.2 棉蚜DPPS2基因cDNA全长序列的获得32-33
2.2.3 棉蚜DPPS的氨基酸序列分析33-36
2.2.4 棉蚜DPPS的系统进化分析36-38 2.3 讨论38-39第三章 棉蚜DPPS编码基因的原核表达和功能分析39-68 3.1 材料与方法39-55
3.1.1 供试昆虫39
3.1.2 主要试剂39-41
3.1.3 主要仪器41
3.1.4 表达载体简介41-45
3.1.5 pET28a-AgDPPS重组蛋白的表达45-49
3.1.6 pET42a-AgDPPS重组蛋白的表达、纯化及GST标签的切除49-51
3.1.7 棉蚜DPPS重组酶活性检测51
3.1.8 棉蚜DPPS在大肠杆菌体内功能分析体系的构建51-54
3.1.9 体内功能分析体系表达产物辅酶Q的提取和检测54-55 3.2 结果与分析55-66
3.2.1 pET28a-AgDPPS融合表达载体的构建、转化55-56
3.2.2 pET28a-AgDPPS重组蛋白表达56-58
3.2.3 pET28a-AgDPPS重组蛋白表达优化58-59
3.2.4 pET42a-AgDPPS融合表达载体的构建59-61
3.2.5 pET42a-AgDPPS重组蛋白的表达和纯化61-62
3.2.6 棉蚜DPPS重组酶活性检测62-63
3.2.7 棉蚜DPPS在大肠杆菌体内共表达体系构建63-65
3.2.8 辅酶Q的提取与检测65-66 3.3 讨论66-68第四章 棉蚜GGPPS基因的克隆及分析68-83 4.1 材料与方法68-76
4.1.1 供试昆虫68
4.1.2 主要试剂68-69
4.1.3 主要仪器69-70
4.1.4 技术路线70
4.1.5 棉蚜GGPPS基因cDNA全长的克隆70-75
4.1.6 氨基酸序列比对及系统进化分析75-76 4.2 结果与分析76-82
4.2.1 棉蚜GGPPS基因cDNA序列的获得76-78
4.2.2 棉蚜GGPPS基因和氨基酸序列分析78-80
4.2.3 棉蚜GGPPS系统进化分析80-82 4.3 讨论82-83第五章 棉蚜GGPPS编码基因的重组表达和功能分析83-97 5.1 材料与方法83-90
5.1.1 供试昆虫83
5.1.2 主要试剂83-84
5.1.3 主要仪器84-85
5.1.4 表达载体简介85
5.1.5 pET28a-AgGGPPS重组蛋白的表达85-88
5.1.6 pET28a-AgGGPPS重组蛋白的纯化88-89
5.1.7 棉蚜GGPPS重组酶活性检测89-90 5.2 结果与分析90-95
5.2.1 pET28a-AgGGPPS融合表达载体的构建、转化90-92
5.2.2 pET28a-AgGGPPS重组蛋白表达和纯化92-94
5.2.3 棉蚜GGPPS重组酶活性检测94-95 5.3 讨论95-97第六章 结论、创新点与展望97-100 6.1 主要结论97-98 6.2 创新点98-99 6.3 展望99-100参考文献100-113其他研究工作113-116致谢116-118作者简介118
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光合微肥是将作物生长所必需的微量元素，和光呼吸抑制剂复合研制而成的一种新型微肥。据试验，一般对小麦、水稻、玉米、花生、棉花、大豆等作物增多１５～３０％；对瓜果可增产３０％以上；大棚蔬菜增产效果也较显著。一般投入产出比为１∶５０～３００。施用方法：每６６
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