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重组大肠杆菌BL21（DE3）%2frbLF-N高密度培养条件优化培养,条件,3/,rbLF,条件优化,大肠杆菌,反馈意见
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重组大肠杆菌BL21（DE3）%2frbLF-N高密度培养条件优化
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3秒自动关闭窗口朱芸, 周有治, 储建林, 何冰芳. 大肠杆菌BL21(DE3)膜组分相关基因的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响[J]. 微生物学报,): .
Zhu Yun, Zhou Youzhi, Chu Jianlin, He Bingfang. Effects of knockout genes related to outer membrane on extracellular secretion of recombinant proteins in Escherichia coli BL21(DE3)[J]. Acta Microbiologica Sinica, ): .
大肠杆菌BL21(DE3)膜组分相关基因的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响
朱芸1, 周有治1, 储建林1, 何冰芳1, 2
1南京工业大学生物与制药工程学院，江苏 南京 211816 2南京工业大学药学院，江苏 南京 211816
资助课题: 国家自然科学基金()；国家“973”项目(2011CBA00807)
作者简介：朱芸(1990-)，女，江苏张家港人，硕士研究生，主要从事重组蛋白胞外分泌的研究。E-mail:
通讯作者: Tel/Fax: +86-25-；
摘要: 【目的】 探究Escherichia coli BL21(DE3)中膜组分相关的脂多糖合成基因waaF或msbB的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响。【方法】 运用Red重组技术将E. coli BL21(DE3)染色体上的基因waaF或msbB敲除，构建敲除菌株E. coli BL21(ΔwaaF)、E. coli BL21(ΔmsbB)。将本实验室保存的带有β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase, β-FFase)、青霉素G酰化酶(penicillin G acylase, PGA)基因的重组质粒pET-ffase、pET-pga分别转入敲除菌株及出发菌株中，构建工程菌株E. coli BL21(ΔmsbB)/pET-ffase、E. coli BL21(ΔwaaF)/pET-ffase、E. coli BL21(DE3) / pET-ffase、E. coli BL21(ΔmsbB)/pET-pga、E. coli BL21(ΔwaaF)/pET-pga、E. coli BL21(DE3)/ pET-pga。最后通过摇瓶发酵研究敲除菌株对β-FFase、PGA胞外分泌的影响。【结果】 当诱导表达4 h，以出发菌株E. coli BL21(DE3)为宿主时，β-呋喃果糖苷酶β-FFase的胞外分泌量占总表达量的2.6%，以敲除菌株ΔmsbB为宿主时，胞外分泌量达到19.7%，而以敲除菌株ΔwaaF为宿主时，胞外分泌量达到50.9%。另外，当诱导表达24 h，以敲除菌株ΔwaaF为宿主时，青霉素G酰化酶PGA的胞外酶活是出发菌株中的4.1倍，达到1708 U/L。【结论】 本研究成功构建了敲除菌株ΔmsbB和ΔwaaF，ΔmsbB能明显增强β-FFase的胞外分泌，而ΔwaaF对β-FFase和PGA的胞外分泌均有显著的强化作用。
大肠杆菌BL21(DE3)&&&&膜脂&&&&基因敲除&&&&
Effects of knockout genes related to outer membrane on extracellular secretion of recombinant proteins in Escherichia coli BL21(DE3)
Zhu Yun1, Zhou Youzhi1, Chu Jianlin1, He Bingfang1, 2
1College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing, 211816, Jiangsu Province, China 2School of Pharmaceutical Sciences, Nanjing Tech University, Nanjing, 211816, Jiangsu Province, China
Abstract:[Objective] We knocked out the genes related to lipopolysaccharide in outer membrane of Escherichia coli BL21(DE3) to study the effects on extracellular secretion of recombinant proteins. [Methods] We generated waaF or msbB knockout mutants [E. coli BL21 (ΔwaaF) or E. coli BL21(ΔmsbB)] of E. coli BL21(DE3) by using lambda-Red recombination system. Then, we transformed recombinant plasmids pET-ffase or pET-pga into E. coli BL21 (ΔmsbB), E. coli BL21(ΔwaaF) and E. coli BL21(DE3) respectively, to generate the engineering strains E. coli BL21(ΔmsbB)/pET-ffase , E. coli BL21(ΔwaaF)/pET-ffase, E.coli BL21(DE3)/ pET-ffase, E. coli BL21(ΔmsbB)/pET-pga, E. coli BL21(ΔwaaF)/pET-pga and E.coli BL21(DE3) /pET-pga. Finally, we studied the effects of mutants on extracellular secretion of beta- fructofuranosidase (EC 3.2.1.26, beta-FFase) and penicillin G acylase (EC 3.5.1.11) in shaking flask fermentation. [Results] After induced expression for 4 hours, up to 19.7% of the beta-FFase activity was found in the culture medium with the msbB deletion mutant, and 50.9% with the waaF deletion mutant, compared to the original 2.6%. Besides, after induced expression for 24 hours, up to 1708 U/L extracellular activity of penicillin G acylase was found in the culture medium with the waaF deletion mutant, which was 4.1 times of the original. [Conclusion] Knockout mutants (ΔmsbB and ΔwaaF) had significantly higher excretion of beta-FFase and the waaF deletion mutant had higher excretion of penicillin G acylase.
Key words:
Escherichia coli BL21(DE3)&&&&membrane lipid&&&&gene knock-out&&&&
大肠杆菌表达系统是目前基因工程中最常用的重组蛋白表达系统，它不仅操作简单、成本低廉，还可以快速大规模地生产目的蛋白。但其胞外分泌能力还是有限，又因为大肠杆菌胞质内缺乏蛋白质折叠所需的酶和辅因子，会导致中间体大量积聚，容易形成包涵体。而重组蛋白若能分泌至周质甚至穿过细胞外膜直接分泌至胞外培养基中，可以极大简化下游复性及分离纯化工艺，减少表达蛋白对宿主菌的毒性和代谢负担。
Escherichia coli BL21(DE3)是pET系统的常用表达宿主菌，pET系统使用T7启动子，是有史以来在大肠杆菌中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。E. coli BL21(DE3)菌株已经做了一系列的遗传修饰改良。其中通过特异性外膜蛋白分解酶基因ompT的突变，提高了外源蛋白在表达体系中的稳定性；通过特异性识别DNA序列蛋白基因hsdSB的突变，保持了插入DNA的稳定性；另外，通过胞嘧啶甲基化酶基因dcm的突变，更易于获得非甲基化质粒[, ]。然而大肠杆菌对重组蛋白的胞外分泌能力仍然很有限，根据我们所能检索的资料表明：之前的遗传修饰改良尚未涉及到通过敲除E. coli BL21(DE3)中脂多糖合成的相关基因waaF或msbB来提高大肠杆菌细胞外膜通透性的策略。
脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞外膜外侧重要的结构和功能分子，一般由三部分组成，由内向外依次是疏水性的类脂A、核心寡糖和由重复性糖单元构成的O-抗原[, ]。它的组成和结构与细胞完整性、外膜通透性、菌膜的形成及细菌抗干燥能力等细胞生化特性密切相关[, , ]。通过研究LPS的合成过程，可以人为地改造其结构，从而改造革兰氏阴性细菌的外膜通透性，同时希望能进一步增强重组蛋白的胞外分泌。waaF基因是E. coli BL21(DE3) 中脂多糖庚糖转移酶Ⅱ的基因，该酶的作用是将庚糖Ⅱ连接到庚糖Ⅰ上，从而完善脂多糖中核心寡糖的结构。msbB基因是E. coli BL21(DE3)中用于类脂A生物合成的十四烷酸转移酶的基因，该酶的作用是将十四烷酸添加到类脂A的C3’位上，成为一条次级脂肪酸链。已有文献报道[]，敲除E. coli W3110中类似功能基因waaF或lpxM均能导致突变株表现出较高的细胞外膜通透性，且对菌体生长速率影响不大。
本研究以常用表达宿主菌E. coli BL21(DE3)为出发菌株，通过Red同源重组技术分别敲除其脂多糖合成的相关基因waaF或msbB来构建细胞膜渗漏突变菌株，同时成功将其应用于提高多功能果糖苷酶和青霉素G酰化酶的胞外分泌效率，为后期将这两种敲除菌株应用于增强其他重组蛋白的胞外分泌奠定了基础。
材料和方法
菌株、质粒和试剂：
大肠杆菌BL21(DE3)由本实验室保存。“大肠杆菌基因删除试剂盒”购自江苏锐阳生物科技有限公司，主要包括：质粒pKD46(同源重组辅助质粒，温度敏感型复制子，含有受ParaB启动子调控的Red重组酶基因，L-阿拉伯糖诱导后表达Gam、Bet和Exo 3种λ噬菌体重组酶)；抗性片段dif-Gmr-dif(两侧带有dif位点的庆大霉素抗性基因片段，dif位点能够由大肠杆菌自身所含有的Xer重组酶进行识别，从而实现靶基因突变后抗性基因的消除)。质粒pET-ffase由本实验室保存，带有自身信号肽的β-呋喃果糖苷酶的基因[, ]克隆入表达载体pET-22b(+)中。质粒pET22b-pga由本实验室保存，来源于大肠杆菌的青霉素G酰化酶基因[]克隆入表达载体pET-22b(+)中。
各种限制性内切酶、DNA聚合酶、T4 DNA连接酶及pMD18-T均购自TaKaRa公司，L-阿拉伯糖购自南京都莱生物技术有限公司，蔗糖购自西陇化工股份有限公司，2-硝基-5-苯乙酰胺基苯甲酸(NIPAB)购自Sigma公司。本实验室所用到的培养基为LB、LB+Glucose (1 g/L)和SOC(用于大肠杆菌电转化之后的恢复培养)。实验中氨苄青霉素(Amp)、庆大霉素(Gm)在培养基中的终浓度分别为100、30 mg/L。
从NCBI获得E. coli BL21(DE3)中的waaF基因序列和msbB的基因序列，设计引物waaF-F和
waaF-R用于扩增waaF的基因序列；引物msbB-F和msbB-R用于扩增msbB的基因序列。反向PCR引物fxwaaF-F和fxwaaF-R用于去除waaF中部部分序列，分别扩增waaF基因两端长约220 bp的同源序列；反向PCR引物fxmsbB-F和fxmsbB-R用于去除msbB中部部分序列，分别扩增msbB基因两端长约210 bp的同源序列。引物waaF-IF和waaF-IR是waaF基因同源序列上下游的鉴定引物，用于检测waaF是否被敲除；引物msbB-IF和msbB-IR是msbB基因同源序列上下游的鉴定引物，用于检测msbB是否被敲除；本研究中使用的引物序列见表1。本研究中所用引物和测序工作由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
表1 本研究中使用的引物
Table 1 Primers used in this study
Sequences (5′→3′)
TTGCTGAAGGTGTAACGGA
CCGTCAGACTTCCTCTTGTAA
ACTTGAACTTATCATCAGGCG
TCCGAAACTGGAAAAGCAT
TGGTTGCCTTGTATGGTCC
TGACCGAGAGGCATAGGAA
AGCTTTTTCCCAGTCGTCC
GATGATCTGTTAGAGGCGG
TTGTTGGCTTCCGCTATTT
CATCCGTCAGACTTCCTCTT
TTACTAACCCGATGCCGAC
GATTCTTGCGATTCCCGAC
敲除waaF、msbB的线性打靶片段的制备
用引物waaF-F和waaF-R扩增E. coli BL21(DE3)染色体DNA上的waaF基因片段，PCR产物克隆入质粒pMD18-T载体中，获得重组质粒pMD18T-waaF。以该重组质粒为模板，用反向PCR引物fxwaaF-F和fxwaaF-R进行反向PCR扩增，获得两端分别带有约220 bp同源臂，中间为pMD18-T骨架的线性片段。接着将反向PCR产物与dif-Gmr-dif片段通过T4 DNA连接酶进行连接，获得重组质粒pMD18T-waaF’(dif-Gmr-dif)。重组质粒pMD18T-waaF’ (dif-Gmr-dif)用EcoRⅠ、HindⅢ进行双酶切，胶回收waaF’(dif-Gmr-dif)线性片段，最后用引物
waaF-F和waaF-R扩增即可得敲除waaF的线性打靶片段，该线性打靶片段由dif-Gmr-dif片段(约1.0 kb)及其两端各带有约220 bp的同源臂组成。敲除msbB的线性打靶片段的制备方法同上。相应地，敲除msbB的线性打靶片段由dif-Gmr-dif片段(约1.0 kb)及其两端各带有约210 bp的同源臂组成。
E. coli BL21(DE3)中waaF、msbB基因的敲除
具体敲除方法参照文献[]。
敲除菌株 (ΔwaaF、ΔmsbB) 的生长曲线测定
分别挑取出发菌株 E. coli BL21(DE3)、敲除菌株 E. coli BL21(ΔwaaF) 和 E. coli BL21 (ΔmsbB)的单菌落接种于50 mL液体LB培养基或液体LB+Glucose(1 g/L)培养基，37 ℃、200 r/min过夜培养后，按2%的接种量转接到100 mL液体LB培养基或液体LB+Glucose(1 g/L)培养基中，37 ℃
200 r/min继续培养，每隔2 h测定菌的OD600。
β-呋喃果糖苷酶、青霉素G酰化酶在出发菌株和敲除菌株中的表达
将重组质粒pET-ffase、pET-pga分别转入敲除菌株及出发菌株中，得到重组菌株E. coli BL21(ΔmsbB)/pET-ffase、E. coli BL21(ΔwaaF)/pET-ffase、E. coli BL21(DE3)/pET-ffase、E. coli BL21(ΔmsbB)/pET-pga、E. coli BL21(ΔwaaF)/pET-pga、E. coli BL21(DE3)/pET-pga。
将以上6种重组菌接种于含100 mg/L Amp的液体LB+Glucose(1 g/L)培养基中，37 ℃培养过夜，次日再以2%的接种量将过夜菌液接种到新鲜的含100 mg/L Amp的液体LB+Glucose(1 g/L)培养基中，37 ℃培养至OD600为1.0左右。含有β-呋喃果糖苷酶基因的3种重组菌株加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，30 ℃诱导。含有青霉素G酰化酶基因的3种重组菌株加入终浓度为5 g/L的乳糖，25 ℃诱导。取1 mL发酵液作为样品，离心取上清作为胞外酶液，沉淀用1 mL ddH2O重悬后超声破碎，再次离心取上清作为胞内酶液。获得的胞外、胞内酶液用于SDS-PAGE分析及酶活测定。
β-呋喃果糖苷酶的酶活测定：
在pH6.5，50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4的缓冲溶液中，30 ℃下催化342 g/L蔗糖水解，以每分钟生成1 μg葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U，即μg/min)。催化生成的葡萄糖由SBA-40E生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)测定。
青霉素G酰化酶的酶活测定：
采用2-硝基-5-苯乙酰胺基苯甲酸(NIPAB)为底物的比色法进行青霉素G酰化酶酶活的测定[, ]。在pH7.5，50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4的缓冲溶液中，37 ℃下催化2 g/L NIPAB，以每分钟生成1 μmol 5-氨基-2-硝基苯甲酸(ANBA)所需的酶量定义为一个酶活力单位(U,即μmol/min)。由Power WaveTM微孔板扫描分光光度计(BioTek)进行测定。
应用Red重组系统和Xer重组系统进行基因敲除的策略
本研究所使用的基因敲除策略如图1所示，包括如下步骤：从大肠杆菌BL21(DE3)染色体上PCR扩增目的突变基因waaF、msbB，并将其克隆入pMD18-T载体中分别获得重组质粒pMD18T-waaF和pMD18T-msbB。以该重组质粒为模板，通过反向PCR扩增两端分别带有约200 bp同源臂，中间为pMD18-T骨架的线性片段，之后将反向PCR产物与抗性片段dif-Gmr-dif连接，可分别获得含有“同源臂1- dif-Gmr-dif -同源臂2”的打靶片段的重组质粒pMD18T-waaF’(dif-Gmr-dif)、
pMD18T-msbB’(dif-Gmr-dif)。将打靶片段从质粒上回收下来，电转化至含同源重组辅助质粒pKD46的出发菌株(E. coli BL21(DE3))感受态中，线性打靶片段两端的同源臂与BL21(DE3)染色体上的目的突变基因waaF、msbB在Red重组酶的作用下进行双交换，使得目的突变基因被线性打靶片段替换掉，这种突变株再在自身Xer重组酶的介导下进行两个dif位点的重组从而消除庆大霉素抗性基因和一个dif位点。
本研究中基因敲除策略图
Strategy of genes knock-out in this study
waaF、msbB敲除菌株的构建
为了验证已进行waaF、msbB敲除操作的菌株，用引物waaF-IF和waaF-IR进行菌落PCR鉴定，成功敲除waaF基因并消除抗性基因和一个dif位点后的重组子(ΔwaaF)获得886 bp的条带(图2中的泳道2)，而出发菌株BL21(DE3)获得1511 bp的条带(图2中的泳道1)；相应地，用引物
msbB-IF和msbB-IR进行菌落PCR鉴定，成功敲除msbB基因并消除抗性基因和一个dif位点后的重组子(ΔmsbB)获得1695 bp的条带(图2中的泳道4)，而出发菌株BL21(DE3)获得2269 bp的条带(图2中的泳道3)。为了进一步证实核酸序列，将最后的重组子ΔwaaF、ΔmsbB分别使用鉴定引物
waaF-IF/waaF-IR、msbB-IF/msbB-IR进行扩增，然后将PCR产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序结果经Vector NTI软件进行序列比对，与预测的一致。之后，另外分别设计了waaF、msbB同源臂上下游引物进行交叉验证，结果与原来一致。这表明我们已经成功地构建了大肠杆菌BL21(DE3)的waaF、msbB敲除菌株，分别记为ΔwaaF和ΔmsbB。
waaF、msbB敲除菌株的菌落PCR鉴定
Characterization of defined waaF or msbB knock-out mutants by colony-PCR analysis. M: DNA lane 1: the colony-PCR product of BL21(DE3) using primers waaF-IF and waaF-IR; lane 2: the colony-PCR product of ΔwaaF using primers waaF-IF and waaF-IR; lane 3: the colony-PCR product of BL21(DE3) using primers msbB-IF and msbB-IR; lane 4: the colony-PCR product of ΔmsbB using primers msbB-IF and msbB-IR.
出发菌株 (BL21(DE3)) 与敲除菌株 (ΔmsbB、ΔwaaF) 的生长曲线
脂多糖结构的改变，可能导致大肠杆菌细胞外膜的结构和功能不完整，使得其生长受到一定抑制。为此测定了出发菌株BL21(DE3)和敲除菌株ΔmsbB、ΔwaaF分别在液体LB培养基(图3-A)、液体LB+Glucose(1 g/L)培养基(图3-B)中的生长曲线。结果表明：在所试2种培养基中，敲除菌株ΔmsbB与出发菌株BL21(DE3)的生长状况基本保持一致，没有明显差异。但是敲除菌株ΔwaaF的生长却受到一定抑制。另外，3种菌株在液体LB+Glucose(1 g/L)培养基中生长较LB培养基中好，说明一定量的葡萄糖对它们的生长有促进作用。
出发菌株(BL21(DE3))与敲除菌株(ΔmsbB、ΔwaaF)分别在液体LB培养基(A)和液体LB+Glucose(1 g/L)培养基(B)中的生长曲线
The growth curve of BL21 (DE3),ΔmsbB and ΔwaaF in LB medium (A) or LB+Glucose (1 g/L) medium (B).
β-呋喃果糖苷酶在敲除菌株中的胞外分泌效果
为了验证敲除菌株(ΔmsbB、ΔwaaF)对β-呋喃果糖苷酶(约55 kDa)胞外分泌效率的影响，将果糖苷酶分别在菌株E. coli BL21(DE3)、E. coli BL21(ΔmsbB)和E. coli BL21(ΔwaaF)中诱导表达4 h，表达样品的SDS-PAGE结果见图4，酶活结果见表2。
β-呋喃果糖苷酶β-FFase在重组菌株中胞外(A)和胞内(B)表达产物的SDS-PAGE图
SDS-PAGE analysis of extracellular (A) and intracellular (B) proteins of recombinants. M: lane 1: E. coli BL21(DE3)/pET-ffase; lane 2: E. coli BL21(ΔmsbB)/pET-ffase; lane 3: E. coli BL21 (ΔwaaF)/pET-ffase.
表2 β-呋喃果糖苷酶 β-FFase 在重组菌株中的胞外及胞内酶活
Table 2 Extracellular and intracellular enzyme activity of beta-fructofuranosidase in recombinant strains
Extracellular activity/
[U/(mL·OD600)]
Intracellular activity/
[U/(mL·OD600)]
The ratio of extracellular activity to the total /%
E.coli BL21(DE3)/pET-ffase
E.coli BL21(ΔmsbB)/pET-ffase
E.coli BL21(ΔwaaF)/pET-ffase
从图4-A中可见，β-呋喃果糖苷酶β-FFase的胞外分泌量在以下3种菌株中依次明显增大，即BL21(DE3)＜ΔmsbB＜ΔwaaF，说明本实验构建的敲除菌株ΔwaaF和ΔmsbB均能显著提高果糖苷酶的胞外分泌量；而从图4-B中还可以看到，β-FFase的胞内表达量在以下3种菌株中依次明显减小，即BL21(DE3)＞ΔmsbB＞ΔwaaF，推测敲除菌株中有更多的β-FFase渗漏到了胞外培养基中。从表2中可以看出，以出发菌株BL21(DE3)为宿主时，β-FFase的胞外分泌量占总表达量的2.6%，以敲除菌株ΔmsbB为宿主时，β-FFase的胞外分泌量占总表达量的19.7%，以敲除菌株ΔwaaF为宿主时，β-FFase的胞外分泌量占总表达量的50.9%。但是同时可以发现，使β-FFase胞外分泌效果更加显著的ΔwaaF也受到了较大的生长抑制，诱导4 h后其OD600的值只有出发菌株BL21(DE3)的72.6%。
青霉素G酰化酶在敲除菌株中的胞外分泌效果
为了验证敲除菌株(ΔmsbB、ΔwaaF)对青霉素G酰化酶(含2个亚基，其中α亚基分子量约25 kDa，β亚基分子量约62 kDa)胞外分泌效率的影响，将青霉素G酰化酶分别在菌株E. coli BL21(DE3)、E. coli BL21(ΔmsbB)和E. coli BL21(ΔwaaF)中诱导表达4、8、12、16、20和24 h，发酵液上清的酶活比较结果见图5，SDS-PAGE结果见图6。
青霉素G酰化酶PGA在出发菌株(BL21(DE3))及敲除菌株(ΔmsbB、ΔwaaF)中诱导表达不同时间的胞外酶活
The extracellular PGA activity of recombinants at different induced times.
青霉素G酰化酶PGA在重组菌株中胞外表达产物的SDS-PAGE图
SDS-PAGE analysis of extracellular proteins of recombinants. M: lane 1,4 and 7: E. coli BL21(DE3)/pET-pga; lane 2,5 and 8: E. coli BL21(ΔmsbB)/pET-pga; lane 3,6 and 9: E. coli BL21(ΔwaaF) /pET-pga
从图5和图6中可明显看到：青霉素G酰化酶PGA在出发宿主菌E. coli BL21(DE3)中表达时有少量分泌到胞外；在以敲除菌株E. coli BL21(ΔmsbB)作为宿主菌时，对PGA的胞外分泌影响不显著；而以敲除菌株E. coli BL21(ΔwaaF)作为宿主菌时，诱导表达12 h 后，PGA的胞外酶活大大提高，诱导表达24 h达到了出发宿主菌中的4.1倍。表明waaF的敲除改变了大肠杆菌细胞外膜的通透性，使更多的PGA通过细胞外膜渗漏到了培养基中。
本研究以常用表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株，通过敲除其脂多糖合成的相关基因waaF或msbB来增强细胞外膜的通透性，进一步提高重组蛋白的胞外分泌能力，并在β-呋喃果糖苷酶β-FFase
和青霉素G酰化酶PGA
的胞外分泌中得到了成功应用。然而大肠杆菌BL21(DE3)的改造却存在一定的难度。白光兴等[]报道，Red重组系统在不同菌株中的作用效果不同，难以在BL21(DE3)中实现基因敲除。张君等[]构建了上下游各500 bp左右同源片段(一般同源臂长度为40-60 bp)的打靶载体才使E. coli BL21(DE3)中类脂A合成相关基因lpxM发生插入失活。本研究采用相似策略构建了上下游各200 bp左右的同源片段成功实现了BL21(DE3)中waaF、msbB基因的敲除。
本研究通过在LB培养基中添加少量的葡萄糖能较显著地促进敲除菌的生长。从生长曲线可见：在LB培养基中，敲除菌株ΔwaaF与出发菌株BL21(DE3)相比生长OD600下降了约26%，而在LB+Glucose(1 g/L)培养基中下降了约19%，有了明显的改善。敲除菌株生长受到抑制的情况在文献[]中也有报道：敲除菌株Δlpp(胞壁质脂蛋白基因)和Δpal(肽聚糖相关外膜蛋白基因)在MR(Modified R)培养基中生长受到限制，但是在TB(Terrific Broth)培养基中其生长恢复。今后可以利用相关培养环境的调整策略来弥补ΔwaaF的生长不足。
本研究构建的敲除菌株均可增强β-呋喃果糖苷酶β-FFase的胞外分泌。在以敲除菌株ΔmsbB或ΔwaaF为宿主菌时，β-FFase的胞外分泌量大大提高，其胞外分泌量占总表达量的比率分别是出发菌株中的7.6倍和19.6倍。而ΔwaaF还可以增强青霉素G酰化酶PGA的胞外分泌。以ΔwaaF为宿主菌时，诱导表达24 h的胞外酶活可达到1708 U/L，是出发菌株中的4.1倍。推测msbB和waaF的敲除确实改变了大肠杆菌BL21(DE3)中的脂多糖结构，特别是ΔwaaF菌株的细胞外膜通透性得到了较显著的提高，这为细胞膜渗漏突变菌株E. coli BL21(ΔmsbB)和E. coli BL21(ΔwaaF)在增强重组蛋白胞外分泌的应用奠定了基础。
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