基于中心重合引物的PCR诱变技术新进展—硕士毕业论文下载
很抱谦，您的浏览器并不支持 IFrame，请与管理员联系，也可。
基于中心重合引物的PCR诱变技术新进展
硕士博士毕业论文站内搜索
全站论文库
硕士博士论文库
普通期刊论文库
分类：→生物科学论文→→→
基于中心重合引物的PCR诱变技术新进展
论文目录&英文缩略语对照表第1-9页 中文摘要第9-10页 英文摘要第10-11页 1 前言第11-23页 　　· 重组PCR诱变法第12-15页 　　　　· 重组PCR定点诱变法第12-13页 　　　　· 重叠延伸PCR技术第13-15页 　　· 大引物PCR(megaprimerPCR)进行基因突变第15-18页 　　　　· Megaprimer PCR法进行单碱基突变第15-17页 　　　　· Megaprimer PCR法进行插入和删除突变第17-18页 　　· Quikchange快速突变法及反向PCR法第18-21页 　　　　· Quikchange法快速制备点突变第18-20页 　　　　· 反向PCR突变方案第20-21页 　　· 本课题研究的目标、内容和意义第21-23页 2 材料与方法第23-35页 　　· 实验药品、试剂与仪器第23-25页 　　· 实验方法第25-35页 3 结果与分析第35-52页 　　· 基于Quikchange原理的改进型突变方法——COP法第35-45页 　　　　· COP法引物设计的优化第35-42页 　　　　· COP突变法的条件优化第42-45页 　　· COP法做删除突变的阳性率及该方法的实际应用第45-50页 　　　　· COP法做删除突变的阳性率第45-47页 　　　　· COP法删除HIV-1 LTR启动子的顺式元件及转录因子结合位点第47-49页 　　　　· 一些用于COP删除法的引物列表第49-50页 　　· COP法用于插入和替代突变(多点突变)的研究第50-52页 　　　　· COP法用于插入或替代突变的引物设计方案第50页 　　　　· COP法用于插入或替代突变(多点突变)的产物阳性率第50-52页 4 讨论与结论第52-56页 5 参考文献第56-59页 致谢第59页
本篇论文共59页，
更多相关论文
栏 目 导 航
Quikchange论文 PCR论文 中心重合引物论文
版权申明：目录由用户jiyuhai提供，仅收录目录，作者需要删除这篇论文目录。
||||||||||
Copyright(C) All Rights Reserved您还可以使用以下方式登录
当前位置：&>&&>&&>& > PCR引物设计及试题分析
PCR引物设计及试题分析
　　PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难于对样品进行分析研究的问题，被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。近年来，有关PCR引物的考查成为高考生物“基因工程”中的一个亮点，对学生思维的灵活性和临场答题的机敏性提出了更高的要求。下面拟通过介绍PCR引物设计的多个原则，望能拓宽学生解题的思路，迁移知识，灵活解题。
　　 一、 PCR引物的设计原则 　　PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 　　要设计引物，首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增片段的单链是否形成二级结构（DNA的二级结构是指两条脱氧多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构）。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 　　然后在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30个碱基对，扩增片段长度为100~600个碱基对。 　　引物序列中（G+C）含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好是随机的。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则引物的设计就不合理，应重新寻找区域设计引物。 　　同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 　　引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 　　综上所述，可以归纳出十条PCR引物的设计原则： 　　①引物应用核酸系列保守区内设计，并具有特异性。 　　②扩增产物的单链不能形成二级结构。 　　③引物长度一般在15~30个碱基对之间。 　　④（G+C）含量在40%~60%之间。 　　⑤碱基要随机分布。 　　⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 　　⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 　　⑧引物5′端可以修饰。 　　⑨引物3′端不可修饰。 　　⑩引物3′端要避开密码子的第3位。 　　 例1 下图1为采用PCR技术从DNA分子中获取目的基因并扩增的部分过程。下图2为获得抗虫棉的技术流程，其中卡那霉素抗性基因（kan）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。请据图回答： 　　（1） PCR中用到的引物是一段已知脱氧核苷酸序列的DNA单链，为保证复制正常进行，引物必须符合的基本要求是除了与目的基因一端互补外，还必须具备_____________ 　　的特点。根据图1分析，至少经过______次循环复制过程，才可从DNA分子中分离出目的基因片段。 　　（2） A过程需要的酶为_______________ 　　_______________________。 　　（3） B过程及其结果体现了质粒作为载体必须具备的两个条件是________________ 　　____________________________________。 　　（4） 为促进土壤农杆菌对重组质粒的吸收，常用________________处理土壤农杆菌。 　　（5） C过程所用的培养基除含有必要营养物质、琼脂外，还必须加入__________，有利于愈伤组织形成。 　　（6） 若该转基因植株自交后代的具有卡那霉素抗性基因的植株比例为3／4，说明卡那霉素抗性基因已存在于该转基因植物细胞的________上。若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占_______%。 　　 答案 （1） 相互之间不能互补 3 　　（2） 限制性核酸内切酶和DNA连接酶 　　（3） 具有标记基因；能在宿主细胞中复制并稳定保存 　　（4） Ca2+ 　　（5） 植物激素（或生长素和细胞分裂素） 　　（6） 染色体（或核DNA，只写DNA不得分） 100 　　创新一 以往关于PCR技术引物的问法常为：与体内DNA复制相比，PCR反应体系需加入__________种引物和_______________。答案为：2、耐高温的DNA聚合酶。需2种引物，学生往往是从DNA复制时两条母链均作模板来考虑。2种引物除分别与目的基因一端互补外，还必须具备__________的特点，学生就难于得出结论。试想2种引物如果本身相互之间能够互补，形成了双链，这就难于保证它们再分别与目的基因一端互补配对了。 　　创新二 以往关于PCR技术DNA复制有关计算的问法常为：假如引物都用3H标记，从理论上计算，DNA片段经3次扩增所得的8个DNA分子中含有3H标记的占_______%；假定DNA片段含200对脱氧核苷酸，经3次扩增，从理论上计算需要__________个游离脱氧核苷酸等。这些问题学生常常通过DNA半保留复制特点容易求到。现改问，根据图1分析，至少经过__________次循环复制过程，才可从DNA分子中分离出目的基因片段？有的学生认为复制一次就行了，这是没有审清题意“目的基因片段”造成的，事实上，第一次复制形成的子链比目的基因片段的一条链要长，见图1；由此子链为模板再进行复制，形成的子链正好和目的基因的一条链一样长；再由和目的基因一条链一样长的子链为模板进行复制，形成的双链DNA片段这才是目的基因片段，故至少经过3次循环复制过程。 　　 例2 请回答基因工程方面的有关问题： 　　（1） 利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。 　　图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。 　　①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_______。 　　②在第_______轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。 　　（2） 设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。 　　①第1组：_________________________； 　　②第2组：_________________________。 　　（3） PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为____________________。 　　（4） 用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图（1 kb即1 000个碱基对），请置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。 　　 答案 （1） 15/16 三 　　（2） 引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 　　（3） DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上 　　（4） 见下图。 　　创新一 （1）问中①如仅经过一轮循环，通过图示DNA半保留复制形成两个DNA片段，一个含引物A，一个含引物B，则含引物A的DNA片段所占的比例为50%。如再经一轮循环，分别又用引物A、引物B。学生易思维定势，类推得出第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例仍为50%。事实上，经过第四轮循环，共形成16个DNA片段，只有最初需要引物B与之配对的模板链作模板合成的DNA片段中有引物B、没有引物A外，其余的模板链合成的DNA片段中都将含有引物A，引物A要么在模板链上，要么在刚合成的子链中，故正确答案为15/16。本小问的创新之处在于用到DNA复制半保留的特点，但又超出该特点。 　　创新二 （1）问中②与例1（1）问中“至少经过__________次循环复制过程，才可从DNA分子中分离出目的基因片段。”相似，至少在第三轮循环产物中才开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。本小问的创新之处在于单靠理解DNA的复制原理是不够的，解题时需画草图，增强对引物作用的认识。 　　创新三 （2）问中已强调设计的两组引物都不合理，在不熟悉PCR引物设计原则的情况下，分析推理的确有难度。学生一般知道引物相互之间不能互补，而在第1组引物中，引物Ⅰ和引物Ⅱ仅有两个连续的碱基互补，要找理由，也只能是它了；而在第2组引物中，引物Ⅰ′和引物Ⅱ′还没有两个连续的碱基互补，但引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对，也就因无法与模板链结合而失效，这就需要学生从图表中获取丰富的信息临场发挥了。本小问的创新之处在于不仅考查了引物之间不能有多个连续的碱基互补外，还考查了引物自身也不能有多个连续碱基的互补，需要学生灵活迁移。 　　创新四 （3）问中已清楚说出PCR技术中所使用的DNA聚合酶具有热稳定性的特点，其具体功能学生大多似懂非懂，一般只知道与形成磷酸二酯键有关。图中是将两个游离的脱氧核苷酸形成磷酸二酯键，现要找出错误原因，其关键还是在于考查引物的作用。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。本小问的创新之处在于不再是简单地考查PCR中学生普遍知道的所使用的DNA聚合酶具有热稳定性的特点，而在于考查DNA聚合酶以及引物的真实作用。
欢迎转载：
推荐： 　　　24小时热门版块排行榜&&&&
【悬赏金币】回答本帖问题，作者流年如梦将赠送您 20 个金币
(正式写手)
在线: 64.7小时
虫号: 4500980
注册: 性别: MM专业: 植物遗传学
引物序列中有括号代表什么已有2人参与
从文献中找到一些通用引物，可是有些引物序列有括号是什么意思啊？如：(TA)TGGT(CT)(AGT)(TC)(TC)TAGAGGAAGTAA，我要是拿来用的话是不是只用括号外的呢？
& 猜你喜欢
已经有85人回复
已经有11人回复
已经有17人回复
已经有43人回复
已经有13人回复
已经有39人回复
已经有19人回复
已经有19人回复
已经有5人回复
已经有103人回复
(正式写手)
在线: 64.7小时
虫号: 4500980
注册: 性别: MM专业: 植物遗传学
兼并引物？什么鬼？
(著名写手)
散金: 4783
在线: 308.4小时
虫号: 127413
注册: 专业: 园艺学与植物营养学
【答案】应助回帖
★ ★ 感谢参与，应助指数 +1myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。
不能，应该是兼并引物
(正式写手)
散金: 1436
在线: 119.8小时
虫号: 1383389
注册: 性别: GG专业: 植物病理学
引用回帖:: Originally posted by 流年如梦 at
兼并引物？什么鬼？ 这个位置可能是不同的碱基
(正式写手)
在线: 118.5小时
虫号: 3623577
注册: 专业: 抗体工程学
是简并引物。和密码子的简并性一个意思。
小木虫,学术科研互动社区,为中国学术科研免费提供动力
违规贴举报删除请发送邮件至：
广告投放与宣传请联系 李想 QQ：
QQ：&&邮箱：
Copyright &
MuChong.com, All Rights Reserved. 小木虫 版权所有文献中好多说用通用引物进行pcr扩展什么意思_百度知道
文献中好多说用通用引物进行pcr扩展什么意思
我有更好的答案
一般载体的生产厂家会在多克隆位点两端加上一对已知序列的引物，用来做PCR验证和测序。所以一般介绍了是什么载体，直接说通用引物对于业内人士来说，通用引物的名称和序列都是已知的了
采纳率：85%
又疑瑶台镜，
为您推荐：
其他类似问题
换一换
回答问题，赢新手礼包
个人、企业类
违法有害信息,请在下方选择后提交
色情、暴力
我们会通过消息、邮箱等方式尽快将举报结果通知您。24小时热门版块排行榜&&&&
(著名写手)
散金: 2045
在线: 176.3小时
虫号: 3888955
注册: 专业: 植物学研究的新技术、新方
知道引物的名称，如何查找引物序列呢！希望可以帮助下已有5人参与
& 猜你喜欢
已经有85人回复
已经有11人回复
已经有17人回复
已经有43人回复
已经有13人回复
已经有39人回复
已经有19人回复
已经有19人回复
已经有5人回复
已经有103人回复
& 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
已经有2人回复
已经有5人回复
已经有21人回复
已经有6人回复
已经有5人回复
已经有1人回复
已经有1人回复
已经有3人回复
已经有28人回复
孤单是生活的常态。
(正式写手)
散金: 531沙发: 1
在线: 67.7小时
虫号: 4214084
注册: 性别: GG专业: 生物物理、生物化学与分子
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
我觉得你还不如把引物名称说出来，让别人帮忙找找呢
相关版块跳转
我要订阅楼主
的主题更新
小木虫,学术科研互动社区,为中国学术科研免费提供动力
违规贴举报删除请发送邮件至：
广告投放与宣传请联系 李想 QQ：
QQ：&&邮箱：
Copyright &
MuChong.com, All Rights Reserved. 小木虫 版权所有