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即送15丁当
请教 Polybrene 转染
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这个帖子发布于12年零323天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
那位同仁做过Polybrene的真核转染，操作注意那些东西？急需！谢谢帮忙
不知道邀请谁？试试他们
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Polybrene 配制用 0.9%的NaCl 溶解Polybrene 干粉（浓度为10 mg/ml），高压灭菌，可以在4 ℃稳定存放1 年，也可冻存于-20℃。干粉可以在4 ℃ 稳定存放数年。
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1、用好的转染试剂，比如，Lipotamine 20002、注意细胞状态，融合率80％左右3、注意质粒的纯度4、严格按照顺序和时间混合转染试剂和质粒5、摸索最佳的质粒和转染试剂的比例
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本人认为以上朋友说的有误，Polybrene主要用在反转录病毒颗粒感染细胞，而不是常规的脂质体转染细胞。具体的方法情参考Clontech公司的说明PT3132－1
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现在是早上2：24分，不小心在分子克隆实验指南（第三版）P1303上看到了Polybrene进行DNA转染的方法详细介绍。描述如下：“对其他转染方法不敏感的细胞系可以在促进DNA转染进细胞的DMSO的存在情况下利用几种聚阳离子，包括Polybrene（Kawai and Nishizawa 1984, Chaney et al. 1986)与聚-L-鸟氨酸()进行转染。在P1305有详细的方法步骤，根据我的理解，以上二人都有误。polybrene转的是裸DNA（无载体DNA），它本身就是聚阳离子，所以也不需要Lipotamine 2000，也不是转逆转录病毒载体的。强烈推荐这本书哦。花了我168两银子。
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建议以上朋友看看Clontech公司的说明书PT3132－1
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如果我没有做过这种实验，我是不会随便发表评论的！Polybrene主要用在反转录病毒颗粒感染细胞，而非象tuwaiwai朋友所理解“也不是转逆转录病毒载体的”
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不好意思，我再看看。书多了，有时候会误人的。对不起。
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所说分子克隆实验指南（第三版）翻译有很多不好的地方。反正我觉得确实读起来很生涩。
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我也是用于逆转录病毒转染时采用的
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可以polybrene终浓度 6-8ug/ml加入产生的病毒上清中，促进病毒感染目的细胞的。
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shaneshi 如果我没有做过这种实验，我是不会随便发表评论的！Polybrene主要用在反转录病毒颗粒感染细胞，而非象tuwaiwai朋友所理解“也不是转逆转录病毒载体的”I use polybrene in retrovirus infection experiment.But, in Molecular Cloning 3rd, there's a protocol of &DNA transfection using polybrene&.
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polybrene用什么溶液稀释呢
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这个聚凝胺 是从哪里买的啊？
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慢病毒感染的过程中能添加吗？
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polybrene大概多少钱
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慢病毒感染过程中也可以添加polybrene用于增强感染效率，但是不是所有的细胞都适用，同时polybrene对某些细胞毒性较大，建议先做预实验测试，polybrene可以直接从sigma购买干粉。
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我用polybrene 和chondroitin sulfate辅助lentivirus感染原代血管平滑肌细胞
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Polybrene 配制用 0.9%的NaCl 溶解Polybrene 干粉（浓度为10 mg/ml），高压灭菌，可以在4 ℃稳定存放1 年，也可冻存于-20℃。干粉可以在4 ℃ 稳定存放数年。
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polybrene 可以用来转染细胞 ProtocolVolume 4 of the series
pp 363-370DNA Transfection of Mammalian Cells Using Polybrene
(1186.43k)
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关于丁香园　　在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
病毒转染包括以下步骤：1构建载体 2包装提纯病毒 3感染靶细胞。以慢病毒为例。&慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
一、慢病毒载体构建原理：
慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
&对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。对进行稳转细胞株的筛选，为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液提供基础。
二 、慢病毒载体构建及包装流程：
（一）&实验流程（1和2为并列步骤）
1.慢病毒过表达质粒载体的构建设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。
2.慢病毒干扰质粒载体的构建合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体
3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
（二）&实验材料：慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
&三、慢病毒转染细胞实验方法
（一）慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、&慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育。3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。5、继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
（二）慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×105/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。37℃孵育。或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。3、继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。
病毒感染细胞本来效率就较低，一定要注意以下几点：1.感染时的培养基尽量少些；2. 每1ml的培养基中加入5-10ul的Polybrene（储存液浓度为2mg/ml ），可以提高效率约3-5倍。不过病毒感染效率的问题都是相对的，达到自己的研究目的即可。
北京英格恩生物公司最新研发合成一种新型纳米聚合物病毒感染增强试剂(病毒转染试剂) Envirus™，具有对病毒吸附和独有的浓缩功能。Envirus™通过物理作用将病毒大量富集在细胞表面，大大增加病毒与细胞的接触，最大限度促进病毒感染细胞，可大大提高腺病毒，慢病毒，腺相关病毒，逆转录病毒等病毒的感染效率，并且细胞毒性很小。通常情况下，比不用Envirus™增强剂，提高感染效率20-50倍。
&病毒感染细胞本来效率就较低，整个过程相对复杂难操作，一般一次花费周期至少两三个月，多则几个月到十几个月不等，经费也是几万到十几万。万一实验失败需要重复操作会花费更多的时间和开支。所以有效提高病毒转染效率是病毒转染细胞的关键。(/)
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联系信箱：&>&&>&第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探_阮峥
第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探_阮峥 投稿：万峯峰
doi:10.3969/j.issn.14.06.004生物技术通讯研究报告第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探阮峥，王文天，杨洋，段永娟，胡晓中国医学科学院、北京协和医学院血液学研究所血液病医院实…
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doi:10.3969/j.issn.14.06.004
生物技术通讯
第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探
阮峥，王文天，杨洋，段永娟，胡晓
中国医学科学院、北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室，天津300020
［摘要］目的：对目前最为常用的三质粒慢病毒包装系统进行优化，以期明确各质粒表达的病毒成分对提高慢病毒包装效率的重要性。方法：在限定总质粒量为10μg的情况下，将表达绿色荧光蛋白（GFP）的目的质粒、表达gag/pol、Rev、VSVG的包装质粒按不同比例混合，转染293T细胞进行病毒包装，48h后收集上清用于感染293T及K562细分析所获病毒的感染效率。结果：采用不同的质粒混合比例包装胞，72h后经流式细胞术检测GFP+阳性细胞比例，同时分别将表35%（3.5μg）时，GFP+293T细胞比例从14.2%升至45.1%,增加了3.2倍。当固定目的质粒量为35%，的病毒感染效率具有明显差异，其中携带GFP的目的质粒量影响作用最为显著，当目的质粒量从15%（1.5μg）增至
为1.5倍；而改变VSVG质粒量达gag/pol或Rev的质粒量从15%提高到25%时，改变Rev组的GFP+阳性率提升最明显，在已测试的混合比例中作用不显著。包装病毒感染K562细胞的结果与293T细胞类似。结论：通过对比包装病毒的感染效率，优化了慢病毒包装的混合质粒条件，并成功地应用于感染白血病细胞系；首次发现提高Rev质粒量可以更有效地提高病毒的包装效率，为利用慢病毒表达体系研究多种基因在血液系统中的功能奠定了技术基础。［关键词］慢病毒表达体系；包装质粒；Rev［中图分类号］Q78
［文献标识码］A
［文章编号］（0-05
OptimizationoftheHIV-1BasedThreePlasmidsLentiviruralPack?agingSystemandInvestigationoftheImportanceofRevExpressionPlasmid
StateKeyLaboratoryofExperimentalHematology,InstituteofHematologyandBloodDiseaseHospital,Chinese
*Correspondingauthor,E-mail:xiaohu@
RUANZheng,WANGWen-Tian,YANGYang,DUANYong-Juan,HUXiao*
AcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Tianjin30020,China
［Abstract］Objective:Inordertoproduceahigh-tierviralparticles,thisstudyhasoptimizedtheratiooflenti?viralpackagingplasmidsusedforthethirdgenerationHIV-1basedlentivectorexpressionsystem.Methods:TheHIV-1basedexpressionlentivector,pHEGP（containstheGFPfluorescencegene）,wasmixedwiththeotherthree
packagingplasmids,expressinggag/pol,RevandVSVGrespectively,indifferentratios.Afixedamountof10μgtainingvirialparticleswascollectedandusedfortransducingHEK293TandK562cellrespectively.Thetiterof
plasmidmixturewastransientlytransfectedintoHEK293TcelllinewithLipofectAMINE2000.Supernantantcon?tionrangesfrom14%to68%,showingthattheratioofindividualplasmidsinthemixturedirectlyaffectthetitervirionwasassessedbythepercentageofGFPpositivecellsviaflowcytometry.Results:TheGFPpositivefrac?
ofpackagedvirion.WhenincreasetheexpressionlentivectorpHEGPfrom15%（1.5μg）to35%（3.5μg）,a2.2theamountoftargetgeneexpressionplasmidat35%andincreasetheportionofgag/polorRevexpressionpackag?ingplasmidfrom15%to25%,thecorrespondingGFP+cellincreased115%and150%respectively.Meanwhile,TransducingofK562cellswithpackagedvirionachievedresultssimilartothosein293Tcells.Conclusion:Our
收稿日期：基金项目：国家重点基础研究发展计划（）；国家自然科学基金面上项目（）；协和医学院协和学者项目（2010-；天津市应用基础及前沿技术研究计划（11JCYBJC27400）；人事部留学人员择优资助项目（2012年）；实验血液学国家重点实2013年）
验室自主课题（Z-12-02，Z-13-02）作者简介：阮峥（1988-），男，硕士研究生通信作者：胡晓，（E-mail）xiaohu@
foldincrease,thecorrespondingGFP+293Tcellincreasedfrom14.2%to45.1%，a3.2foldincrease.Whenfixed
differentratiosofVSVGplasmiddidnotshowsignificanteffectonthepercentageofGFP+cellinthisstudy.
阮峥等：第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探
studyoptimizedtheratioofindividualplasmidsinthelentiviralpackagingsystem.Forthefirsttime,ourresultsforfurtherstudiesongenefunctionsinmanybloodandstemcellswiththelentiviralexpressionsystem.
suggestedthatincreasingtheratioofRevexpressingplasmidcanimprovethetiterofviralparticlesmoreefficient?lythanthegag/polandVSVGplasmid.Theoptimizedpackagingsystemwouldhavepotentialofwideapplications
［Keywords］lentiveRev
慢病毒基因表达系统是目前广泛使用的基因操作工具。该表达系统由用于表达特定基因的目的质粒及病毒gag/pol、Rev和VSVG等组分的包装质粒组成，其中包装质粒提供了病毒基因组mRNA包装成完整毒粒所必需的结构蛋白、聚合酶和包膜蛋白。获得高滴度的病毒是后期开展基因功能研究的关键。在实际工作中，研究人员大多采用商业化的慢病毒包装产品，或仅将各个包装质粒进行简单混合，通常难以获得针对所研究目的基因的最优化的病毒包装效率。Kumar等[1]系统研究了不同慢病毒载体质粒的包装能力，发现随着插入片段的延长，病毒滴度呈半对数形式下降，目的质粒愈长则包装活力毒粒的能力愈下降。当研究的目的基因较大时，选择优化后的病毒包装体系才可能得到高效率的病毒毒粒。然而，针对病毒包装体系各组分以获得高效病毒的研究尚为欠缺。我们利用目前广泛应用的三质粒包装体系，对慢病毒包装时目的质粒及各包装质粒的比例进行多个条件的包装效率比较研究，初步分析了慢病毒包装各组分的作用意义，着重比较了Rev表达质粒对提高包装病毒效率的作用，以期建立高效的可用于多种细胞感染的慢病毒包装系统。
材料与方法
中，当细胞密度达到90%时经0.25%胰酶-EDTA消化传代培养；K562细胞培养于含10%FBS的IMDM
每48~培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，
72h离心换液。复苏实验室保藏的pLVX-EF1a-GFP-N1（pHEGP）、pLP1、pLP2和pLP-VSVG等5株大肠杆菌DH5α，振荡培养过夜后用QIAGEN大提试剂盒提取质粒，经测序验证正确。1.3慢病毒包装
慢病毒包装系统由目的质粒、pLP1、pLP2和pLP-VSVG共4种质粒按一定比例组成，考虑到细胞对质粒的转染存在饱和度，因此在控制总质粒量不变的原则下（10μg/60mm中皿），同时改变2个变量，考察2个变量间的比例关系及重要性。混合质粒通过脂质体（LipofectAMINE2000）转染293T细胞，48h后收取含病毒粒子的上清，离心、过滤后置于4℃或-80℃保存。
1.4病毒感染293T及K562细胞
感染前一天于6孔板中接种5×105的293T或K562细胞，感染时加入1mL病毒上清（对照组为1mLPBS）、1mLDMEM或IMDM完全培养基及终浓度为8μg/mL的polybrene，加入病毒后12h换液，3d后荧光镜检观察GFP荧光，并用流式细胞分析
计算病毒感染阳性率。仪检测GFP+细胞百分率，
293T细胞与K562细胞由中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）实验血液学国家重点实验室细胞库提供（购自ATCC）；感受态大肠杆菌DH5α购自TIANGEN公司；慢病毒包装的目的质粒pLVX-EF1a-GFP-N1（pHEGP）购自TaKaRaClontech公司；病毒包装质粒pLP1-gag/pol、pLP2-Rev和pLP-VSVG购自Invitrogen公司。
IMDM、DMEM、OPTI-MEM低血清培养基、PBS、胎牛血清（FBS）和0.25%胰酶-EDTA购自Gibco公司；LipofectAMINE2000购自Invitrogen公司；poly?brene购自Sigma公司；质粒提取试剂盒为QIAGENPlasmidMiniKit及MaxiKit；超速离心管购自Nal?gene公司；0.45μm滤器购自Millipore公司；低温超高速离心机为BeckmanCoulter公司的AvantiJ-30I；数字化分析型流式细胞仪为BD公司的LSRII。1.2细胞培养与质粒制备
293T细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基
目的质粒量是影响病毒包装效率的首要因素以采用不同质粒比例进行病毒包装获得的病毒上清感染293T细胞，由于目的质粒表达GFP荧光蛋白，因此感染后GFP细胞阳性率可用于反映病毒的感染率差异。流式细胞检测结果显示，不同条件获得的病毒上清感染293T细胞的GFP阳性率最低组仅11.5%，最高组可达66.8%，说明改变质粒比例会显著影响病毒包装效率。
首先分析目的质粒pHEGP与其余3个包装质粒对病毒包装效率的影响。当pLP1-gag/pol和pLP-VSVG质粒均为2.5μg时，3.5μgpHEGP、1.5μgpLP2-Rev组比1.5μgpHEGP、3.5μgpLP2-Rev组细胞的阳性率提高到约3倍（图1）。在pHEGP与pLP1-gag/pol以及pHEGP与pLP-VSVG的比较中，同样发现提高目的质粒量同时递减某一包装质粒量可显著提升GFP阳性率（数据未示）。以上结果说
明，与几个包装质粒相比较，目的质粒的量是影响病毒包装效率的首要因素。
2.2不同包装质粒的重要性有差异，pLP2-Rev是影响病毒滴度的关键因素
明确目的质粒量对病毒包装效率的决定性地位后，进一步分析3个包装质粒之间的重要性。将目的质粒pHEGP固定为3.5μg、3个包装质粒总量定为6.5μg，分别依次提供低剂量（1.5μg）Rev、gag/pol和VSVG。当提供低剂量VSVG质粒时，病毒感染293T细胞的GFP细胞阳性率为66.8%；提供低剂量Rev质粒时，GFP细胞阳性率低至45.1%；提供低剂量gag/pol质粒时，GFP细胞阳性率居中为54.9%（图2A）。说明Rev质粒量对高效病毒包装具有至关重要的作用。降低Rev剂量导致病毒包装效率下降最为显著，而减少VSVG用量仍可高效包装病毒。将gag/pol和Rev与VSVG剂量间的相互作用进行对比发现，当采用低剂量VSVG时，增加Rev相对含量较增加gag/pol含量能更好地提升病毒滴度（图2B）。2.3白血病细胞系K562中再现包装病毒的感染效
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血液细胞及干细胞通常较贴壁细胞的病毒感染效率低，因此对病毒的滴度更为敏感。基于采用贴壁的293T细胞感染筛选优化的病毒包装条件，我们进一步利用白血病细胞系K562细胞考察不同条件包装病毒的感染效率。由流式细胞分析GFP阳性细胞的结果发现（图3），采用不同质粒比例包装的病毒在K562细胞中同样导致差异的病毒感染率，并且分别改变Rev、gag/pol和VSVG表达质粒的剂量均可取得与感染293T细胞相同趋势的结果。
图1比较目的质粒量对病毒包装效率的影响
图示为流式细胞术分析不同包装条件获得的病毒感染293T细胞中GFP阳性细胞百分率，显示pHEGP较pLP2-Rev有更高优先级
图2各包装质粒量对病毒包装效率的影响
A：流式细胞术分析不同包装条件获得的病毒感染293T细胞中GFP阳性细胞百分率；B：改变Rev质粒量更有效提高病毒包装效率
图3比较不同包装条件获得的病毒感染红白血病恶性细胞系K562细胞的结果
流式细胞术结果中x轴为FITC通道信号强度，y轴为前向散射光（FSC）强度，结果显示pLP2-Rev较pLP1-gag/pol
有更高优先级
阮峥等：第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探
第三代慢病毒包装系统用于不同研究中的质粒比例
包装基因GFPHIF-1aRev1，Polη，RAD18
TARP4-13-TCRpremiR-127
GFPGAP7-28zGFP
感染细胞类型NIH3T3人胎肝基质细胞
PBMC或CD8+T细胞MCF7，MDA-MB-231
人原发性T细胞参考文献［2］
［3］［4］［5］［6］［7］［8］［9］[10］本研究
载体∶pLP1∶pLP2∶pLP-VSVG
6.5∶4.5∶1.5∶2.55∶4.2∶2∶2.81∶1∶1∶15∶4.2∶2∶2.81∶1∶1∶2X*∶7∶3∶43∶4.5∶1∶24.5∶3∶2∶1.53讨论
基于HIV的慢病毒载体系已成为在哺乳动物细
胞中研究基因功能的主流方法，但目前国内外学者采用包装系统中的质粒比例却不尽相同（表1）。大部分研究者在工作中仅采用商业化质粒或简单比例混合，尚未对慢病毒包装系统各成分进行系统优化，尤其是并未意识到pLP2-Rev的比例在病毒滴度提升中的重要性，因此本研究工作具有现实意义。
本研究表明目的质粒量是影响病毒滴度的决定条件，并首次发现Rev蛋白是影响有效毒粒的关键因素。Cochrane等发现Rev蛋白与病毒基因组mRNA上的特定序列RRE（Revresponseelement）元件结合形成稳定的Rev-RNA二级结构，该结构对于基因组mRNA的出核运输具有关键作用[11]。该结合位点突变会导致Rev-RNA结构异常，进而扰乱病毒的核输出。此外，BSA偶联的Rev激活结构域（BSA-R）能够显性抑制Rev介导的RNA核输出[12]。可见Rev蛋白对于形成完整长度的病毒基因组RNA至关重要，病毒基因组RNA的核输出是保证完整病毒RNA的关键步骤。这些观点支持了我们的实验结果——高比例的Rev蛋白可显著提高病毒的感染效率。高剂量Rev蛋白才能实现病毒基因组RNA的高效核输出，避免其被细胞自身的防御系统降解。相对Rev而言，gag/pol的重要性次之，pLP1-gag/pol主要提供病毒的结构蛋白及反转录酶和整合酶特性，对于慢病毒活性毒粒必不可少。而VSVG作为包膜
对于整个蛋白，仅在细胞与病毒融合时发挥作用[13]，
病毒的活性周期而言处于较次要的地位。综上，我们得出了慢病毒包装系统中4个质粒的相对优先重要性等级，即目的质粒>Rev>gag/pol>VSVG。
已有的研究表明目的质粒中插入片段长度与病
探索慢病毒包装优化毒滴度呈半对数形式负相关[1]，
体系应选择较长的目的质粒作为实验对象，因此实验中选用了此前构建的GFP表达载体pHEGP。该载体在5'-LTR与3'-LTR间插入约2kb的片段，大小接近中等长度的基因插入片段。在此情况下进行
病毒包装效率的改进，可以更好地模拟实际基因功能研究中体系优化的差异性。实验中对病毒包装效率的评价采用未经浓缩的病毒上清，是基于两方面的考虑，一方面排除超速离心或超速过滤过程中的干扰因素，另一方面排除高滴度浓缩病毒可能对感染率差异的掩盖。
针对建立稳定表达细胞系或难以进行普通转染的实验，通过慢病毒进行基因扰动是当前基础医学的主流方法。慢病毒不仅具有高效率滴度，而且对于发育早期的多能干细胞，尤其是造血干细胞具有不可替代的优势。慢病毒包装作为各大实验室及公司的重要技术基础，建立优化包装体系以提高长基因过表达效率非常重要。我们的实验结果表明，相对低剂量的pLP-VSVG和相对高剂量的pLP2-Rev是优化第三代慢病毒包装体系的重点，这点在低MOI的293T细胞系及较高MOI的K562细胞系中都得到验证，为实现在血液细胞中相关基因的稳定表达和后续功能研究奠定了技术基础。
KumarM,KellerB,MakalouN,etal.Systematicdetermina?tionofthepackaginglimitoflentiviralvectors[J].HumanGeneTher,):.
mammaliancellsbysmallinterferingRNAknockdownof5836.
ChuC,ShatkinAJ.Apoptosisandautophagyinductionin
mRNAcappingenzymes[J].MolCellBiol,):5829-[3]
MayT,EcclestonL,HerrmannS,etal.Bimodalandhysteret?icexpressioninmammaliancellsfromasyntheticgenecircuit[J].PloSOne,):e2372.
[4]JiL,LiuYX,YangC,etal.Self-renewalandpluripotency
ismaintainedinhumanembryonicstemcellsbyco-cultureiblefactor1alpha[J].JCellPhysiol,):54-66.
withhumanfetalliverstromalcellsexpressinghypoxiainduc?[5]
HicksJK,ChuteCL,PaulsenMT,etal.Differentialroles
ofintrastrandversusinterstrandDNAcross-links[J].MolCell[6]
forDNApolymeraseseta,zeta,andREV1inlesionbypass
ZhangJ,WangS,YuanL,etal.Neuron-restrictivesilencer
factor(NRSF)repressescocaine-andamphetamine-regulatedtranscript(CART)transcriptionandantagonizescAMP-responseanism[J].JBiolChem,):.
element-bindingproteinsignalingthroughadualNRSEmech?[7]
HillerdalV,NilssonB,CarlssonB,etal.Tcellsengineered
生物技术通讯
[10]ZhangG,WangL,CuiH,etal.Anti-melanomaactivityofT
cellsredirectedwithaTCR-likechimericantigenreceptor[J].
[11]CochraneAW,ChenCH,RosenCA.Specificinteraction
withaTcellreceptoragainsttheprostateantigenTARPspe?cificallykillHLA-A2+prostateandbreastcancercells[J].ProcNatlAcadSciUSA,):.
ofthehumanimmunodeficiencyvirusRevproteinwithaUSA,):.
structuredregionintheenvmRNA[J].ProcNatlAcadSci[12]FischerU,HuberJ,BoelensWC,etal.TheHIV-1Revac?
portpathwayusedbyspecificcellularRNAs[J].Cell,):475-483.
[8]ChenJ,WangM,GuoM,etal.miR-127regulatescellpro?liferationandsenescencebytargetingBCL6[J].PloSOne,):e80266.
KrasnerNM,IdoY,RudermanNB,etal.Glucagon-like
tivationdomainisanuclearexportsignalthataccessesanex?
inflammationthroughacalciumandAMPKdependentmecha?nism[J].PloSOne,):e97554.
peptide-1(GLP-1)snalogliraglutideinhibitsendothelialcell
[13]EmiN,FriedmannT,YeeJK.Pseudotypeformationofmu?
rineleukemiaviruswiththeGproteinofvesicularstomatitisvirus[J].JVirol,):.
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2015年《中国消毒学杂志》征订启事
《中国消毒学杂志》是军事医学科学院1984年创办的国家级消毒学理论与应用性刊物。本刊主
要介绍国内外有关消毒与灭菌的科研成果、工作经验和理论知识。主要栏目有：实验研究、调查研究、综述、专题讲座、疫源地消毒、医院感染控制、医院消毒与灭菌、消毒监测、卫生防疫消毒、信息交流、经验交流等。内容注重科学性、实用性和针对性，适合广大卫生防疫人员，高、中级医护人员，以及从事科研、教学、食品、制药与兽医等工作同志阅读参考。《中国消毒学杂志》编委为全国科研、教学和实践中有经验的专家。本刊自创刊以来，以其较高的学术水平和丰富的科技信息深受读者欢迎。
《中国消毒学杂志》是中国科技核心期刊，为中文核心期刊要目总揽入编期刊、中国医药卫生核心期刊、中国数字化期刊群源期刊、中国科技论文统计源期刊、中国学术期刊（光盘版）源期刊、中国期刊网源期刊、中国学术期刊综合评价数据库源期刊、中国知网全文收录期刊、中文生物医学核心期刊。国外被美国化学文摘（CA）及其索引全文收录。
《中国消毒学杂志》为月刊，每月15日出版，国际标准开本A4,96页，统一刊号：CN11-2672/R,ISSN,。本刊每期订价10元，全年价120.00元（含邮费），国内外公开发行，国内由北京报刊发行局发行，邮发代号82-328。国外由中国国际图书贸易集团有限公司发行，国外代号MO4174。读者可到当地邮局直接订阅。
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doi:10.3969/j.issn.14.06.004生物技术通讯研究报告第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探阮峥，王文天，杨洋，段永娟，胡晓中国医学科学院、北京协和医学院血液学研究所血液病医院实…
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