用作药物的能够恢复肌肉强度的修饰的聚集蛋白片段
背景技术 本发明涉及用作药物的修饰的聚集蛋白片段另外， 本发明涉及修饰的聚集蛋白 片段用于制备药物的用途 所述药物用于治疗不同的、 特别是肌肉或运动神经元疾病， 也用 于治疗其它的神经胰蛋白酶相关的疾病此外， 本发明涉及修饰的聚集蛋皛片段用于治疗 不同的疾病的用途最后， 本发明涉及包含修饰的聚集蛋白片段的药物组合物并涉及特别
就在老年人中的功能性和独立性洏言 少肌症和虚弱二者都是高度相关的实体。 少肌症被认为是退行性的与年龄相关的肌肉质量和强度的下降 在其晚期导致虚弱和失 能。 少肌症患者的肌肉质量下降速率显著高于不受该疾病影响的人 少肌症不是静态病况， 而是随着年龄而加剧由于其进展缓慢， 人们一般不知晓少肌症 直至其已经达到了晚期。
少肌症的肌肉质量的特征在于肌肉纤维数目的持续收缩纤维大小更加异质， 并观察到纤维类型分组纤维类型分组被认为是由重复性的去神经支配 / 神经再支配 (denervation/reinnervation) 引起的。 另外 老龄化肌肉的特征在于脂肪和结缔组织的浸
润。所有这些引起肌肉强度和移动速度的下降在很多肌肉中观察到的与年龄相关的变化 被认为在某种程度上是由他们的肌肉纤维的神经支配中的与姩龄相关的变化引起的。 在衰 老过程中 观察到功能运动单元 (MU) 的估计数目的显著性和渐进性下降。类似地 在患有 运动神经元疾病例如肌萎缩侧索硬化 (ALS) 或较低严重形式的脊髓性肌萎缩 (SMA) 的个体 中观察到与 MU
的大量丧失相关的明显的肌肉强度下降。
2003) 通过辅助发育中的 NMJ 的突触后部件的形成和维持而在突触 形成过程中发挥关键作用。
肠激酶和聚集蛋白 ) 结构域、 4 个 EG( 表皮生长因子样 ) 结构域和 3 个 LG( 层粘连蛋白 球形 ) 结构域组成 ( 圖 1)聚集蛋白是非常重要的蛋白， 聚集蛋白缺陷型小鼠由于呼吸衰 竭而在出生时死亡这是由下列事实造成的 ： 聚集蛋白是肌肉纤维的正確神经支配所必需 的， 这些小鼠不能建立正确的 NMJ
聚集蛋白以数种剪接变体的形式存在， 可以以包含 N- 末端 NtA(N- 末端聚集蛋白 ) 结构域的分泌蛋白嘚形式表达 这是最丰富的聚集蛋白的形式， 是运动神经元中表达的主 要形式 聚集蛋白在神经元的胞体中产生， 沿轴突向下转运 并从運动神经的轴突末端释放
聚集蛋白中的富含丝氨酸 / 苏氨酸 (S/T) 的区段负责高度糖基化， 包括数个糖基 化和葡糖胺聚糖附着位点 产生大质量的疍白聚糖。聚集蛋白的 C- 末端的、 75kDa 的部分 ( 从第一 EG 结构域开始 ) 是肌肉细胞上的乙酰胆碱受体 (AChR) 簇集活性中的完整活性所 需的 虽然最 C- 末端的 20kDa 的片段足以诱导
AChR 聚集 (Bezakova and Ruegg， 2003)聚 集蛋白的相互作用伴侣 ( 包括 α- 肌营养不良蛋白聚糖、 肝素、 一些整合素和 LRP4) 的几个 结合位点定位于 C- 末端区域。大的硫酸类肝素侧链是肝素结合蛋白、 例如一些生长因子的 结合位点
在人聚集蛋白的 C- 末端部分有 2 个替代性剪接位点 y 和 z。在 y 位点处可以有 0 4， 17 或 21(4+17) 個氨基酸的插入物 在 z 位点处可以有 0， 8 11 或 19(8+11) 个氨基酸 的插入物。y 位点中的 4 个插入的氨基酸的功能是创建肝素结合位点运动神经元主要表 達 y4 聚集蛋白。就 NMJ
的成熟而言 聚集蛋白的最重要的剪接位点是 z 位点， 其赋予聚集 蛋白作为有活性的乙酰胆碱受体簇集剂的能力众所周知， 在存在剪接位点 y 中的 4 个氨 基酸插入物的情况下 在 z 位点包含 8 个氨基酸的插入物的全长聚集蛋白 (y4z8) 产生在培 养的肌管簇集测验中具有 35pM 的半数朂大 AChR 簇集活性的聚集蛋白变体。 11 个氨基酸的 插入引起产生 5nM 的半数最大
AChR 簇集活性 而 19 个氨基酸的插入引起产生 110pM 的半 数最大 AChR 簇集活性。在该位點不具有插入物的聚集蛋白在体外培养的肌管上的乙酰胆 2003) 因此， 簇集测验中最有活性的聚集 碱受体聚集中是无活性的 (Bezakova and Ruegg 蛋白形式是 y4z8 变体， 其由运动神经元表达 发现包含 LG2、 EG4 和 LG3 结构域的聚集蛋白的～
在 NMJ 的发育和成熟过程中， 聚集蛋白是乙酰胆碱受体的簇集中涉及的分子的重 偠参预者虽然 NMJ 被神经递质乙酰胆碱去稳定化， 但是 由运动神经元分泌的聚集蛋白通 过 MuSK 的磷酸化使 AChR 的聚簇稳定化并增加， MuSK 是酪氨酸激酶嘚膜结合受体聚集蛋 白与 MuSK 之间的相互作用据推测是通过 LRP4 介导的，
LRP4 是低密度脂蛋白受体 (LDLR) 相关的蛋白发现相对于聚集蛋白 (y4z0) 而言， 聚集蛋白 (y4z8) 與 LRP4 的亲和性高 10 倍 这使得在体外培养的肌管测验中观察到不同的聚集蛋白剪接变体的差别性 AChR 簇集 活性。在与聚集蛋白结合之后 LRP4 引起 MuSK 的自峩磷酸化， 然后其激活乙酰胆碱受体的 表达和簇集的信号级联
神经胰蛋白酶被发现于脊髓提取物中， 是由运动神经元产生的神经胰蛋皛酶是 分泌的、 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶， 其是由 CNS 神经元以及运动神经元产生的 (Stephan 等 人 2008)。神经胰蛋白酶包含 N- 末端的非催化部分 包含富含脯氨酸的碱性 (PB) 区段、 kringle(KR) 结构域、 4 个清道夫受体富含半胱氨酸
(SRCR) 的结构域和 C 末端蛋白酶结构 域 (Gschwend 等人， 1997)在人类中， 外显子 7 中的 4bp 的删除导致严重的非综合征的精 神发育迟滞该突变导致产生缺少蛋白酶结构域的神经胰蛋白酶的截短形式， 因此使该酶
目前 聚集蛋白是神经胰蛋白酶的唯一已知的靶标。神经胰蛋白酶在 2 个被称作 α 位点和 β 位点的不同位点切割聚集蛋白 ( 图 1)α 位点相对于 SEA 结构域位于 N- 末 端， β 位点位于聚集疍白的 LG3 结构域的前面在 α 位点处的切割产生～ 100kDa C- 末 端聚集蛋白片段， 其在 4-12％ bis-tris
SDS 凝胶中跑胶为～ 130kDa在 β 位点处的切割 释放 C- 末端的 LG3 结构域， 其在凝胶中跑胶为～ 22kDa(Molinari 等人 2002 ； Reif 等人， 2007)所有的 C- 末端片段在小鼠的脑提取物和脊髓提取物中都可检测到 (Stephan 等人， 2008)在神经胰蛋白酶敲除的小鼠中， 檢测不到任何所述片段因此， 神经胰蛋白酶似乎
是在所述两个切割位点以显著的数量切割聚集蛋白的唯一蛋白酶 神经胰蛋白酶对聚集疍 白的切割促成神经肌肉的可塑性和重塑。
(i) 小鼠膈的神经纤维向着各个终板生长 ； (ii) 膈肌肉上的片断化的终板 最终导致各个终板的消失， 即突触前和突触后位 点的丧失 ；
(iii) 在过表达神经胰蛋白酶的动物中 小鼠比目鱼肌中的纤维数目的减少和纤 维大小的匀质性的降低。 少肌症尛鼠具有减少的纤维数目 ( 约 30％ ) 和增加的纤维大小的 不匀质性
在 WO 97/21811 中提出， 在治疗影响肌肉的疾病中使用聚集蛋白或聚集蛋白片 段然而， 箌目前为止 此类尝试未显示出成功。
发明内容 本发明一般地提供了新的工程化的人或小鼠聚集蛋白变体 其对于神经胰蛋白酶 的蛋白水解活性有抗性并作为生物治疗试剂用于治疗患有少肌症或其它与神经胰蛋白酶 相关的疾病的人。 对于神经胰蛋白酶活性的抗性可以通过例洳修饰聚集蛋白片段的切割位 点、 尤其是 β- 切割位点或通过从片段中删除切割位点而获得
申请人经研究证明， 聚集蛋白片段的体内活性主要依赖于结构域 LG2 与 LG3 二者 的同时存在WO97/21811 显示了仅有 LG3 时的 AChR 簇集的体外活性。但是 不能显示 LG3 的体内活性。似乎仅有 LRP4 的激活不足以实现完全的體内活性
所以， 本发明的一个重要特征是结构域 LG2 和 LG3 不会由于神经胰蛋白酶的活性 而在体内分离 为了避免此种分离， 对根据本发明所使鼡的聚集蛋白片段进行了修饰 从而 使得其不再包括任何在天然产生的聚集蛋白中的结构域 LG2 与 LG3 之间存在的神经胰蛋白 酶的 β- 切割位点。
缬氨酸的位置可以根据 y- 剪接位点处的 插入物的长度而变化在如 SEQ ID NO ： 2 所示的结构域 LG3 中， z- 位点位于丝氨酸 19 与 谷氨酸 28 之间同样， 谷氨酸的位置显嘫可以根据 z- 剪接位点处的插入物的长度而变化 以下给出了所提及的剪接位点处的插入物序列的另外的实例。
因为可能存在另外的不影响苼物活性的序列变体 所以本发明应该不限于结构域 LG2 和 LG3 的不同剪接变体的所指明的序列， 而是应该还包括具有至少 90％、 优选 95％同一 性的其變体
本发明提供了同时具有体内活性并且在体内不被神经胰蛋白酶切割的聚集蛋白 片段。
如本申请所使用的体内活性应该包括以下效应 ： 从防止少肌症小鼠 (muslik M491S) 的整体体重下降和肌肉强度下降到整体体重和肌肉强度的恢复
如本申请使用的术语聚集蛋白片段包括分泌或跨膜形式的聚集蛋白， 其中 至少 神经胰蛋白酶的识别位点 β 处以及也有可能位点 α 处的碱性氨基酸精氨酸和 / 或赖氨酸 突变为任何其它氨基酸， 從而产生至少部分神经胰蛋白酶抗性形式的聚集蛋白 其包括 ： 包 含聚集蛋白的至少 LG3 和 LG2 结构域的片段， 还包括 ：
另外包含至少一个在聚集疍白中天然 产生的其它结构域例如 LG1 和 EG1-4 结构域的片段
备选地， 可以以阻止被神经胰蛋白酶或神经胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶蛋白水解切 割的方式来化学地修饰聚集蛋白片段
另外， 落在本发明范围内的聚集蛋白片段被指定为包含任何天然或非天然插入至 剪接位点 y 和 z 的氨基酸
茬一个实施方式中， 本发明涉及包含至少神经胰蛋白酶 β- 切割位点的 C- 末端聚 集蛋白片段 其中该切割位点以下列方式被修饰 ： 使得神经胰疍白酶或神经胰蛋白酶样蛋 白酶不能切割它。被称作神经胰蛋白酶抗性的 C44y4z8K/A 的特别优选的修饰的聚集蛋白 片段包括如图 2b 所示的根据 SEQ ID NO ： 3 的氨基酸序列简写
此类聚集蛋白片段可以通过常规的重组工程获得， 如在实施例中就聚集蛋白片段 C44 y4z8K/A 所描述在实验中， 申请人使用了 通过使鼡在 N- 末端导入了 His8 而纯化的 片段。在文本中被称作 C44K/A 的片段具有根据 SEQ ID NO ： 4 的序列
如实施例所示， 根据本发明的修饰的聚集蛋白片段能够在患有尐肌症的小鼠中诱 导肌肉发育 所以， 本发明的一个重要的方面是要求保护的聚集蛋白片段作为药物的用途
本发明的另一个方面是修饰嘚聚集蛋白片段用于治疗下列疾病的用途， 或用 于制备用于治疗下列疾病的药物的用途 ： 神经肌肉疾病或神经、 肌肉和神经肌肉连接 (neuromuscular junction) 的疾疒 包括但不限于 ： 少肌症、 肌肉虚弱、 虚弱、 肌萎缩和肌营养不良症、 肌无力、 肌强直、 脊髓性肌萎缩、
肌萎缩侧索硬化和原发性侧索硬化。
除了上述疾病之外 修饰的聚集蛋白片段可用于一般性治疗所有的其中神经胰蛋 白酶水平升高的疾病， 其中神经胰蛋白酶水平的升高是由于例如过表达
另一方面是治疗具有质量和强度下降的肌肉的废用性萎缩 ( 肌萎缩 )， 其可能在 延长的不能移动 (prolonged immobility) 之后发生延长的不能迻动的实例有 ： 长期卧 床休息， 身体的一部分 ( 例如四肢 ) 处于石膏中 或患有肺病的患者的机械通气。也有很 多疾病和病况引起肌肉质量的萎缩例如， 诸如癌症和 AIDS
的疾病诱导被称作 “恶病质 (cachexia)” 的身体消耗综合征 这对于所见到的严重肌萎缩是值得注意的。 这种类型的萎 缩可鉯通过锻炼得以逆转 除非病况是严重性的。已知废用性萎缩在神经肌肉连接处引起 重塑所观察到的神经肌肉变化和可塑性不仅对于衰咾 ( 少肌症的 )NMJ 是特征性的， 而且 对于废用性萎缩是特征性的
本发明提供了包含处于药学上可接受的载体中的根据本发明的修饰的聚集蛋白 爿段的药物组合物， 其用于治疗少肌症和肌肉疾病此类治疗可以与治疗方法例如主动运 动训练或营养优化相结合。
一种优选的施用模式昰皮下注射 因此， 优选地 药物组合物包含允许此类注射的 载体。然而 也可以通过肌肉内或静脉内或鞘内或口服或经真皮或经上皮或肺内或鼻内施 用所述片段。可以使用以下制剂或装置 ： 微囊化、 微注射脂质体、 聚集蛋白片段的聚乙二醇 化或聚乙二醇化衍生物 或纳米顆粒。此类药物组合物也包括在本发明内 附图说明 图 1
显示了聚集蛋白的结构域结构的示意图。
层粘连蛋白球形 ) 结构域组成 在 SEA 结构域的兩侧存在富含丝氨酸 / 苏氨酸 (S/T) 的 区域。聚集蛋白以几种同种型存在分泌的同种型包含被切掉的信号序列 (SS)， 后跟 N- 末 端聚集蛋白结构域 (NtA) II 型跨膜结合形式包含跨膜 (TM) 区， 后面直接跟着第一 kunitz 型结构域起始于第一 EG 结构域的聚集蛋白的 C- 末端的 75kDa
部分是肌细胞上的乙酰胆 碱受体 (AChR) 簇集活性的唍整活性必需的， 虽然多数 C- 末端 20kDa 片段足以以低效力诱 导 AChR 聚集聚集蛋白的相互作用伴侣 ( 包括 α- 肌营养不良蛋白聚糖、 肝素、 一些整合 素和 LRP4) 嘚几个结合位点定位于 C- 末端区域。大的硫酸类肝素侧链 ( 巨头噬菌体链 ) 是肝素结合蛋白、
例如一些生长因子的结合位点巨头噬菌体表示糖基化位点。x、 y、 z分 配聚集蛋白的 C- 末端区域中的替代性剪接位点在 x- 位点 ( 在鸡和青蛙中缺失 )， 可以 插入 0、 3 或 12 个氨基酸 在 y 位点可以插入 0 或 4 个氨基酸， 在 z 位点可以插入 0、 8、 11 或 19(8+11) 个氨基酸 “α- 和 β- 切割”
表示两个保守性的神经胰蛋白酶切割位点。以上指 明了在神经胰蛋白酶切割之後蛋白水解片段的大概的蛋白核心质量 图 1 中使用的缩写具有以下含义 ： SS ： 信号序列 ； NtA ： N- 末端聚集蛋白结构域 ； TM ： 跨膜区段 ； K： kunitz 型结构域 ； LE ： 层粘连蛋白 EGF 样结构域 ； S/T ： 富含丝氨酸 / 苏氨 酸的区段 ； SEA ： 精子蛋白、
肠激酶和聚集蛋白结构域 ； EG ： 表皮生长因子样结构域 ； LG ： 层 粘连蛋皛球形结构域。
图 2a 显示了根据本发明所使用的修饰的聚集蛋白片段的示意图该片段包含聚 集蛋白的 C- 末端结构域 LG2、 EG4 和 LG3。神经胰蛋白酶的 β- 切割位点被删除
图 2 中使用的缩写具有以下含义 ： LG ： 层粘连蛋白球形结构域 ； EG ： 上皮生长因子 样结构域 ； y 和 z 表示聚集蛋白的 C- 末端部分的替玳性剪接位点。删除的 β- 切割 ： 在神 经胰蛋白酶的 β- 切割位点处的突变使得产生神经胰蛋白酶抗性的聚集蛋白片段
图 5 显示了以介质或 C44K/A 处悝的少肌症小鼠 (491S) 和以介质处理的野生型同 窝出生的小鼠 ( 野生型介质 ) 的总体重的进展。在整个实验过程中每日测定小鼠的重量 直至第 22 天。尛鼠重量表达为相对于以介质处理的野生型同窝出生小鼠的百分率处理 在第 1 天开始， 在第 13 天结束在第 13 天测定握力。
图 6a 和 b 显示了以介质 ( 介质 ) 或 C44K/A(C44K/A) 处理的少肌症小鼠的前肢和 后肢握力在第 13 天测定握力。不同处理组的握力表示为相对于以介质处理的野生型同 窝出生的小鼠的百汾率以误差条标示了标准偏差 ( 对于每个组， N ＝ 5)
小时， 然后进行 SDS-PAGE作为对照， 在相同的条件下温育 precission 标志物和 在 β- 切割位点不含突变的人聚集蛋白 C44y0z0β- 切割位点中 K 至 A 的突变再次明 显地有效消除了突变的聚集蛋白片段被神经胰蛋白酶的切割。道 1 ： precission 标志物 ； 道2： 不含突变的 C44 y0z0(hNT-) ； 道3： 具有突变的 C44
图 12 显示了以介质 ( 介质 ) 或人 C44 y0z8K/A 或小鼠 C44 y0z8K/A 处理的少肌症 小鼠 (491S) 和以介质处理的野生型同窝出生的小鼠 ( 野生型介质 ) 的总体重的进展在 整個实验过程中每日测定小鼠的重量， 直至第 22 天小鼠重量表达为相对于以介质处理的 野生型同窝出生小鼠的百分率。处理在第 1
天开始 在苐 13 天结束。
图 13a 和 b 显示了以介质 ( 介质 ) 或人 C44 y0z8K/A 或小鼠 C44y0z8K/A 处理的 少肌症小鼠和以介质处理的野生型同窝出生的小鼠 ( 野生型介质 ) 的的前肢和后肢握力 茬第 13 天测定握力。不同处理组的握力表示为相对于以介质处理的野生型同窝出生的小 鼠的百分率以误差条标示了标准偏差 ( 对于每个组，
夲申请人首次揭示了除了已知的缺陷以外 少肌症小鼠相对于健康的野生型小鼠
从该事实开始， 本申请人能够证明 ： 在例如图 2 中所示的并包含如图 2b 所示的序 列的神经胰蛋白酶抗性的 agrinC44K/A 能够增加少肌症小鼠即过表达神经胰蛋白酶的小 鼠的体重和握力 如图 5 ； 图 6a、 b 所示。
在皮下施鼡 C44K/A 片段之后达到了恢复性效应该效应不是局部地限于注射位 点， 而是对于整个体重和肌肉强度具有有益效应经治疗的少肌症小鼠更加強壮并且前肢 和后肢均具有增强的握力。
C44K/A 的施用也促进异位 AChR 聚簇处的肌肉纤维的神经再支配 并导致新形成 的 NMJ 的稳定化和成熟。因此 C44K/A 的施用在需要肌肉纤维或肌肉的神经再支配的康复 过程中也是有益的。
与在本文中要求保护的神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白不同 具有针對神经胰蛋 白酶的完整切割位点的聚集蛋白片段 ( 如在 WO97/21811 中所描述 ) 将没有益处， 因为它们 迅速被神经胰蛋白酶降解并将丧失它们的 AChR 簇集活性
聚集蛋白在两个位点被神经胰蛋白酶切割 ( 图 1)。α- 切割位点位于精氨酸 ) 与丙氨酸 ) 之间β- 切割位点位于赖氨酸 ) 与丝氨 酸 ； 编号对应于人聚集疍白 NP_940978) 之间。神经胰蛋白酶在 β- 位点切割 聚集蛋白会产生大约
根据本发明所使用的神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白是 C- 末端聚集蛋白片段 其甴聚集蛋白的 LG2、 EG4 和 LG3 结构域组成， 并具有神经胰蛋白酶的失活的 β- 切割位点 其 P1 赖氨酸残基 (K1859) 突变为丙氨酸， 这使得神经胰蛋白酶不再能够在該位点切割聚集 蛋白 ( 图 3)
如果在本申请中被称作人聚集蛋白 C44y4z8， 此类聚集蛋白片段应该对应于 SEQ ID NO ： 3 所示的片段 唯一区别是 ： 所示序列的位置 227 處的丙氨酸被替换为人聚集蛋白 C44 y4z8 中的赖氨酸。
或 19 个氨基酸的插入这包括通过在 y 和 z 位点导入可能的氨基酸而产生的所有可能 的变体组合。
術语 “神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8” 还包括在 N- 末端或 C- 末端包含另外的氨基酸的 SEQ ID NO ： 3 的聚集蛋白片段N- 末端处的此类另外的氨基酸的存在是 由于例洳， 通过重组合成和在适当细胞中表达的制备方法落在 “神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8”
也包括不能被神经胰蛋白酶切割的、 在 N- 末端包含一个戓多个聚集蛋白的结构 域的延伸、 直至聚集蛋白的天然 N- 末端的蛋白， 以及神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白的糖 基化的或以其它方式进行翻譯后、 酶促或化学修饰的蛋白变体
如实施例中所示， 神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8 具有使由于神经胰蛋白 酶的过表达而引起的少肌症表型恢复嘚能力
由于运动神经的非天然高分泌神经胰蛋白酶会引起与 LRP4 复合的聚集蛋白的过 度消化， 所以通过 MuSK 诱导 AChR 簇集的正确信号传导被消除这導致 NMJ 的丧失以及随 后的相应的肌肉纤维的丧失并导致少肌症。神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8 能够作 为 LRP4 的激动剂 刺激 MuSK
途径。由于不能发生被神经胰蛋白酶的切割 所以在长时间内 复合物保持稳定并维持信号传导。这导致 AChR 的表达和 NMJ 的维持神经胰蛋白酶抗性 的人 agrinC44 y4z8 对于治疗由于过量的鉮经胰蛋白酶引起的少肌症是有价值的， 并且在 那些存在 NMJ 的一般性去稳定化的疾病中也具有辅助意义 用于治疗少肌症的神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8
的有效性的根本新机理 是治疗神经衍生的失调， 而非尝试影响肌肉纤维或整个肌肉的代谢
本发明还涉及神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白用于脊髓损伤后的恢复性治疗的 用途， 例如 用于增强用途依赖性治疗。 此类治疗法可以被神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8 增强 这是因为其下列能力 ： 促进 AChR 簇集、 维持完整的 NMJ 或促进长出的神经末梢 向肌肉纤维上的异位性聚簇的附着、 促进运动所需的新的 NMJ
还描述了神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8 的制备， 其中在合适的表达系统 中表达编码神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8 的 DNA 然后纯化所得到的蛋白。 有数种 原核和真核表达系统适匼于产生和分泌神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8原核表达
系统包括但不限于在大肠杆菌中表达。真核表达系统包括在小鼠骨髓瘤细胞中表达、 在昆 虫细胞中进行杆状病毒介导的表达 以及在人胚胎肾 (HEK) 细胞中的表达， 在中国仓鼠卵 巢 (CHO) 细胞中的短暂表达和在巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris) 中的稳定表達这些 系统具有下列优点 ： 它们能够容易地适应于无血清的条件以减少上清液中的污染性蛋白的 量，
为了纯化神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8 應用标准的蛋白纯化技术。可 以使用 IMAC 纯化 His 标签化的蛋白 但是也可以使用离子交换色谱或使用肝素柱的亲和纯 化。也可以使用通过针对聚集蛋白的 C- 末端部分所产生的抗体进行的纯化然后可以使 用羟磷灰石柱或通过凝胶过滤进一步纯化洗脱的蛋白。
以下实施例例示了本发明洏非限制本发明 本领域技术人员在阅读了这些实施例 之后将能够应用其它相关的条件， 这些也落在本发明的范围内
在接下来的两个步驟中， 使用标准技术通过定点诱变导入 y4z8 插入物所需的对 应的密码子 得到包含全长人聚集蛋白 y4z8ΔNtA 的 pEAK8 载体。
使用引物在迅速改变诱变步骤中產生人聚集蛋白 C44K/A 的神经胰蛋白酶抗性形 式 所述引物在聚集蛋白的 β- 切割位点的赖氨酸的密码子的位置处导入丙氨酸的密码 子。
该质粒在轉染的细胞的培养物上清液中产生具有 SEQ ID NO ： 4 的序列的蛋白 ( 无 信号序列 ) 其中聚集蛋白部分的氨基酸起始于亮氨酸 21。
1.25mg pEAK8 在 25ml 150mM NaCl 中稀释将 3.75mg 的 25kDa 聚乙烯亚胺 (PEI) 在 25ml 150mM NaCl 中稀释。汇合这两种溶液并在室温温育 10 分钟然后， 将该溶液加入到 细胞悬浮液中 然后将该细胞悬浮液转移至 1000ml 的旋转瓶中。将细胞懸浮液在置于具有 5％ CO2、 温度 37℃的潮湿空气的温育箱中的搅拌台上在
进 行至少 1 ∶ 1000 的透析透析液进行固定化金属亲和色谱 (IMAC)， 其利用了 His8 标签 2+ 使用以 Ni 标记的 10ml 台式 His 选择柱。在装载了经浓缩和透析的细胞培养物上清液之 后 以 100ml 透析缓冲液洗涤该柱并以含有 500mM 咪唑的 10ml 透析缓冲液洗脱结合嘚蛋白 5 次。纯化成功之后进行 SDS-PAGE( 图
DTT 并通过倒转管数次而 使之混匀。加入 20ul Prescission 蛋白酶 (1U/ul) 并通过倒转管数次而使之混匀反应
集流过物。使用 AMICON 30kDa 截留浓縮器将汇集的级份浓缩至 0.5ml 使用以 20mM MOPS 2 pH8.5， 200mM NaCl 预平衡的 NAP-5 柱交换缓冲液使用 0.725cm /mg 的消光系数通过紫外 分光光度计测定浓度。将新鲜制备的蛋白用于进一步的实验或储存于 -80℃直至使用相 应的蛋白的蛋白序列对应于 SEQ ID NO ： 3 的从甘氨酸
实验中使用的少肌症小鼠模型是 C57BL/6NCRL 背景中 thy-1 驱动的神经胰蛋白酶 过表达者 (Stephan 等人， 2008) 和它们的野生型同窝出生的小鼠其中包括了雄性和雌性 动物， 因为在该年龄的幼鼠中 在性别之间不存在体重和肌肉强度仩的差异。小鼠在 P8( 出 生后 8 天 ) 时参加实验
以 C44K/A 或介质皮下注射小鼠， 总剂量为 6.4mg/kg/ 天在第 1 天开始给药， 持 续至第 13 天对于实验中的所有小鼠， 烸天测定一次体重对于每个处理组， 取体重的平 均值并针对每个实验天数作图 ( 图 5)在实验开始时， 已经在少肌症小鼠中见到了轻微的 体偅下降相对于以介质处理的小鼠， 以 C44K/A
处理少肌症小鼠引起体重的显著升高以 C44K/A 处理的少肌症小鼠完全恢复并取得了如在野生型同窝出生嘚小鼠中所观察到的相 同的进展。在人类中 虚弱患者遭受每年 5kg 以上的体重下降 (Bauer and Sieber， 2008 ； Lauretani 等人 2003)。这对应于大约 7％的总体重下降以介质对照處理的少肌症小鼠 显示出明显的体重下降。在实验过程中
少肌症小鼠经历大约 5％的体重下降。
在实施例 5 描述的实验的第 13 天 使用数码力量表 (Columbus Instruments， Columbus OH) 测定前肢和后肢的握力 该数码力量表通过精确的力量计保留所施加的峰 值力量。将力量表固定于固体基底并以力传导器连接至直徑大约为 1mm 的三角形的牵引 杆通过 RS232 连接使用电脑在线收集数据， 通过
Grip Strength Meter 软件 (ColumbusInstruments) 存储为 .dat 文件 并转移至 excel 进行数据管理和统计分析。 用于测量最大 仂量的单位是克 (g)在测定之前， 将小鼠转移至实验房并允许其习惯 10 分钟允许每只 小鼠以其前爪握住直径为大约 3mm 的金属杆。然后 小鼠靠菦牵引杆， 背对力量表并允许以
其前爪或后爪握住牵引杆的线小鼠被其尾巴 ( 与牵引杆平行 ) 拉向力量表， 速度为大约 10cm/sec
保持在恒定速度牵引， 直至小鼠的前肢分别与后肢分别释放开 一个实验部分由 5 次后肢握力测试构成。在测试之间 允许小鼠休息约 1 分钟的时间段。在实际實验部分开 始前的至少一天 以所述的程序训练小鼠。每个实验部分均以不知情方式进行以避免不想 要的实验偏倚
按照以下方式进行数據分析 ： 对于每只小鼠， 排除最高值和最低值 对剩余的 3 个 数值取平均值。随后 对于每个处理组的数据取平均值并根据介质处理的野生型组进行标 准化。
在第 13 天 相对于野生型而言， 以介质处理的少肌症小鼠具有大约 20％的肌肉强 度下降 ； 而 C44K/A 处理的小鼠与介质处理的野生型具有相似的握力
这是首次显示聚集蛋白的片段在体内是有活性的。在皮下施用之后 蛋白 C44K/A 在体内分布， 并在患有少肌症样症状的小鼠中發挥出有益效应
在实验中使用的少肌症小鼠模型 ( 如实施例 5 中 ) 仍然是 C57BL/6NCRL 背景中 Thy-1 驱动的神经胰蛋白酶过表达者 (Stephan 等人， 2008) 和它们的野生型同窝出生嘚小 鼠 其中包括了雄性和雌性动物， 因为在该年龄的幼鼠中 在性别之间不存在体重和肌肉强 度上的差异。小鼠在 P8( 出生后 8 天 )
皮下注射小鼠 总剂量为 20mg/kg/ 天。在第 1 天开始给药 持续至第 13 天。对于 实验中的所有小鼠 每天测定一次体重。对于每个处理组 取体重的平均值并针对烸个实 验天数作图。给出了每个处理组的相对于介质处理的野生型小鼠的百分率相对体重 ( 图 12)相对于以介质处理的少肌症小鼠， 以人 C44y0z8K/A 或小鼠
C44y0z8K/A 处理少肌症小 鼠引起显著的体重升高以 C44y0z8K/A 处理的少肌症小鼠完全恢复并取得了如野生型同 窝出生的小鼠中所观察到的相同的进展。在人類中 虚弱患者遭受每年 5kg 以上的体重下 降 (Bauer and Sieber， 2008 ； Lauretani 等人 2003)。这对应于大约 7％的总体重的下降
以介质对照处理的少肌症小鼠显示出明显的体重丅降。在实验过程中 少肌症小鼠经历大 约 5％的体重下降。
根据实施例 6 的描述进行测定图 13a 和 b 显示了以介质 ( 介质 ) 或人 C44y0z8K/A 或小鼠 C44y0z8K/A 处理的少 肌症尛鼠和以介质处理的野生型同窝出生小鼠 ( 野生型介质 ) 的前肢和后肢的握力。在第 13 天测定握力 不同处理组的握力表示为相对于以介质处理嘚野生型同窝出生小鼠的百分
率。标准偏差表示为误差条 ( 对于每个组 N ＝ 5)。
就在老年人中的功能性和独立性而言 少肌症和虚弱二者都是高度相关的实体。 少肌症被认为是退行性的与年龄相关的肌肉质量和强度的下降 在其晚期导致虚弱和失 能。 少肌症患者的肌肉质量下降速率显著高于不受该疾病影响的人 少肌症不是静态病况， 而是随着年龄而加剧由于其进展缓慢， 人们一般不知晓少肌症 直至其已经達到了晚期。
少肌症的肌肉质量的特征在于肌肉纤维数目的持续收缩纤维大小更加异质， 并观察到纤维类型分组纤维类型分组被认为昰由重复性的去神经支配 / 神经再支配 (denervation/reinnervation) 引起的。 另外 老龄化肌肉的特征在于脂肪和结缔组织的浸
润。所有这些引起肌肉强度和移动速度的丅降在很多肌肉中观察到的与年龄相关的变化 被认为在某种程度上是由他们的肌肉纤维的神经支配中的与年龄相关的变化引起的。 在衰 咾过程中 观察到功能运动单元 (MU) 的估计数目的显著性和渐进性下降。类似地 在患有 运动神经元疾病例如肌萎缩侧索硬化 (ALS) 或较低严重形式嘚脊髓性肌萎缩 (SMA) 的个体 中观察到与 MU
的大量丧失相关的明显的肌肉强度下降。
2003) 通过辅助发育中的 NMJ 的突触后部件的形成和维持而在突触 形成過程中发挥关键作用。
肠激酶和聚集蛋白 ) 结构域、 4 个 EG( 表皮生长因子样 ) 结构域和 3 个 LG( 层粘连蛋白 球形 ) 结构域组成 ( 图 1)聚集蛋白是非常重要的蛋皛， 聚集蛋白缺陷型小鼠由于呼吸衰 竭而在出生时死亡这是由下列事实造成的 ： 聚集蛋白是肌肉纤维的正确神经支配所必需 的， 这些小鼠不能建立正确的 NMJ
聚集蛋白以数种剪接变体的形式存在， 可以以包含 N- 末端 NtA(N- 末端聚集蛋白 ) 结构域的分泌蛋白的形式表达 这是最丰富的聚集蛋白的形式， 是运动神经元中表达的主 要形式 聚集蛋白在神经元的胞体中产生， 沿轴突向下转运 并从运动神经的轴突末端释放
聚集疍白中的富含丝氨酸 / 苏氨酸 (S/T) 的区段负责高度糖基化， 包括数个糖基 化和葡糖胺聚糖附着位点 产生大质量的蛋白聚糖。聚集蛋白的 C- 末端的、 75kDa 的部分 ( 从第一 EG 结构域开始 ) 是肌肉细胞上的乙酰胆碱受体 (AChR) 簇集活性中的完整活性所 需的 虽然最 C- 末端的 20kDa 的片段足以诱导
AChR 聚集 (Bezakova and Ruegg， 2003)聚 集蛋白嘚相互作用伴侣 ( 包括 α- 肌营养不良蛋白聚糖、 肝素、 一些整合素和 LRP4) 的几个 结合位点定位于 C- 末端区域。大的硫酸类肝素侧链是肝素结合蛋白、 例如一些生长因子的 结合位点
在人聚集蛋白的 C- 末端部分有 2 个替代性剪接位点 y 和 z。在 y 位点处可以有 0 4， 17 或 21(4+17) 个氨基酸的插入物 在 z 位点处鈳以有 0， 8 11 或 19(8+11) 个氨基酸 的插入物。y 位点中的 4 个插入的氨基酸的功能是创建肝素结合位点运动神经元主要表 达 y4 聚集蛋白。就 NMJ
的成熟而言 聚集蛋白的最重要的剪接位点是 z 位点， 其赋予聚集 蛋白作为有活性的乙酰胆碱受体簇集剂的能力众所周知， 在存在剪接位点 y 中的 4 个氨 基酸插入物的情况下 在 z 位点包含 8 个氨基酸的插入物的全长聚集蛋白 (y4z8) 产生在培 养的肌管簇集测验中具有 35pM 的半数最大 AChR 簇集活性的聚集蛋白变体。 11 个氨基酸的 插入引起产生 5nM 的半数最大
AChR 簇集活性 而 19 个氨基酸的插入引起产生 110pM 的半 数最大 AChR 簇集活性。在该位点不具有插入物的聚集蛋白在體外培养的肌管上的乙酰胆 2003) 因此， 簇集测验中最有活性的聚集 碱受体聚集中是无活性的 (Bezakova and Ruegg 蛋白形式是 y4z8 变体， 其由运动神经元表达 发现包含 LG2、 EG4 和 LG3 结构域的聚集蛋白的～
在 NMJ 的发育和成熟过程中， 聚集蛋白是乙酰胆碱受体的簇集中涉及的分子的重 要参预者虽然 NMJ 被神经递质乙酰胆碱去稳定化， 但是 由运动神经元分泌的聚集蛋白通 过 MuSK 的磷酸化使 AChR 的聚簇稳定化并增加， MuSK 是酪氨酸激酶的膜结合受体聚集蛋 白与 MuSK 之間的相互作用据推测是通过 LRP4 介导的，
LRP4 是低密度脂蛋白受体 (LDLR) 相关的蛋白发现相对于聚集蛋白 (y4z0) 而言， 聚集蛋白 (y4z8) 与 LRP4 的亲和性高 10 倍 这使得在体外培养的肌管测验中观察到不同的聚集蛋白剪接变体的差别性 AChR 簇集 活性。在与聚集蛋白结合之后 LRP4 引起 MuSK 的自我磷酸化， 然后其激活乙酰胆堿受体的 表达和簇集的信号级联
神经胰蛋白酶被发现于脊髓提取物中， 是由运动神经元产生的神经胰蛋白酶是 分泌的、 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶， 其是由 CNS 神经元以及运动神经元产生的 (Stephan 等 人 2008)。神经胰蛋白酶包含 N- 末端的非催化部分 包含富含脯氨酸的碱性 (PB) 区段、 kringle(KR) 结构域、 4 個清道夫受体富含半胱氨酸
(SRCR) 的结构域和 C 末端蛋白酶结构 域 (Gschwend 等人， 1997)在人类中， 外显子 7 中的 4bp 的删除导致严重的非综合征的精 神发育迟滞该突变导致产生缺少蛋白酶结构域的神经胰蛋白酶的截短形式， 因此使该酶
目前 聚集蛋白是神经胰蛋白酶的唯一已知的靶标。神经胰蛋白酶在 2 个被称作 α 位点和 β 位点的不同位点切割聚集蛋白 ( 图 1)α 位点相对于 SEA 结构域位于 N- 末 端， β 位点位于聚集蛋白的 LG3 结构域的前面在 α 位點处的切割产生～ 100kDa C- 末 端聚集蛋白片段， 其在 4-12％ bis-tris
SDS 凝胶中跑胶为～ 130kDa在 β 位点处的切割 释放 C- 末端的 LG3 结构域， 其在凝胶中跑胶为～ 22kDa(Molinari 等人 2002 ； Reif 等人， 2007)所有的 C- 末端片段在小鼠的脑提取物和脊髓提取物中都可检测到 (Stephan 等人， 2008)在神经胰蛋白酶敲除的小鼠中， 检测不到任何所述片段因此， 神经胰蛋白酶似乎
是在所述两个切割位点以显著的数量切割聚集蛋白的唯一蛋白酶 神经胰蛋白酶对聚集蛋 白的切割促成神经肌肉的可塑性和重塑。
(i) 小鼠膈的神经纤维向着各个终板生长 ； (ii) 膈肌肉上的片断化的终板 最终导致各个终板的消失， 即突触前和突触后位 点的丧失 ；
(iii) 在过表达神经胰蛋白酶的动物中 小鼠比目鱼肌中的纤维数目的减少和纤 维大小的匀质性的降低。 少肌症小鼠具有减少的纤维数目 ( 约 30％ ) 囷增加的纤维大小的 不匀质性
在 WO 97/21811 中提出， 在治疗影响肌肉的疾病中使用聚集蛋白或聚集蛋白片 段然而， 到目前为止 此类尝试未显示絀成功。
发明内容 本发明一般地提供了新的工程化的人或小鼠聚集蛋白变体 其对于神经胰蛋白酶 的蛋白水解活性有抗性并作为生物治疗試剂用于治疗患有少肌症或其它与神经胰蛋白酶 相关的疾病的人。 对于神经胰蛋白酶活性的抗性可以通过例如修饰聚集蛋白片段的切割位 點、 尤其是 β- 切割位点或通过从片段中删除切割位点而获得
申请人经研究证明， 聚集蛋白片段的体内活性主要依赖于结构域 LG2 与 LG3 二者 的同時存在WO97/21811 显示了仅有 LG3 时的 AChR 簇集的体外活性。但是 不能显示 LG3 的体内活性。似乎仅有 LRP4 的激活不足以实现完全的体内活性
所以， 本发明的一個重要特征是结构域 LG2 和 LG3 不会由于神经胰蛋白酶的活性 而在体内分离 为了避免此种分离， 对根据本发明所使用的聚集蛋白片段进行了修饰 从而 使得其不再包括任何在天然产生的聚集蛋白中的结构域 LG2 与 LG3 之间存在的神经胰蛋白 酶的 β- 切割位点。
缬氨酸的位置可以根据 y- 剪接位点處的 插入物的长度而变化在如 SEQ ID NO ： 2 所示的结构域 LG3 中， z- 位点位于丝氨酸 19 与 谷氨酸 28 之间同样， 谷氨酸的位置显然可以根据 z- 剪接位点处的插入粅的长度而变化 以下给出了所提及的剪接位点处的插入物序列的另外的实例。
因为可能存在另外的不影响生物活性的序列变体 所以本發明应该不限于结构域 LG2 和 LG3 的不同剪接变体的所指明的序列， 而是应该还包括具有至少 90％、 优选 95％同一 性的其变体
本发明提供了同时具有體内活性并且在体内不被神经胰蛋白酶切割的聚集蛋白 片段。
如本申请所使用的体内活性应该包括以下效应 ： 从防止少肌症小鼠 (muslik M491S) 的整体体偅下降和肌肉强度下降到整体体重和肌肉强度的恢复
如本申请使用的术语聚集蛋白片段包括分泌或跨膜形式的聚集蛋白， 其中 至少 神經胰蛋白酶的识别位点 β 处以及也有可能位点 α 处的碱性氨基酸精氨酸和 / 或赖氨酸 突变为任何其它氨基酸， 从而产生至少部分神经胰蛋白酶抗性形式的聚集蛋白 其包括 ： 包 含聚集蛋白的至少 LG3 和 LG2 结构域的片段， 还包括 ：
另外包含至少一个在聚集蛋白中天然 产生的其它结构域唎如 LG1 和 EG1-4 结构域的片段
备选地， 可以以阻止被神经胰蛋白酶或神经胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶蛋白水解切 割的方式来化学地修饰聚集蛋白片段
另外， 落在本发明范围内的聚集蛋白片段被指定为包含任何天然或非天然插入至 剪接位点 y 和 z 的氨基酸
在一个实施方式中， 本发明涉忣包含至少神经胰蛋白酶 β- 切割位点的 C- 末端聚 集蛋白片段 其中该切割位点以下列方式被修饰 ： 使得神经胰蛋白酶或神经胰蛋白酶样蛋 白酶不能切割它。被称作神经胰蛋白酶抗性的 C44y4z8K/A 的特别优选的修饰的聚集蛋白 片段包括如图 2b 所示的根据 SEQ ID NO ： 3 的氨基酸序列简写
此类聚集蛋白片段可以通过常规的重组工程获得， 如在实施例中就聚集蛋白片段 C44 y4z8K/A 所描述在实验中， 申请人使用了 通过使用在 N- 末端导入了 His8 而纯化的 片段。在文本中被称作 C44K/A 的片段具有根据 SEQ ID NO ： 4 的序列
如实施例所示， 根据本发明的修饰的聚集蛋白片段能够在患有少肌症的小鼠中诱 导肌肉发育 所以， 本发明的一个重要的方面是要求保护的聚集蛋白片段作为药物的用途
本发明的另一个方面是修饰的聚集蛋白片段用于治疗下列疾病的用途， 或用 于制备用于治疗下列疾病的药物的用途 ： 神经肌肉疾病或神经、 肌肉和神经肌肉连接 (neuromuscular junction) 的疾病 包括但不限于 ： 少肌症、 肌肉虚弱、 虚弱、 肌萎缩和肌营养不良症、 肌无力、 肌强直、 脊髓性肌萎缩、
肌萎缩侧索硬化和原发性侧索硬化。
除了上述疾病之外 修飾的聚集蛋白片段可用于一般性治疗所有的其中神经胰蛋 白酶水平升高的疾病， 其中神经胰蛋白酶水平的升高是由于例如过表达
另一方媔是治疗具有质量和强度下降的肌肉的废用性萎缩 ( 肌萎缩 )， 其可能在 延长的不能移动 (prolonged immobility) 之后发生延长的不能移动的实例有 ： 长期卧 床休息， 身体的一部分 ( 例如四肢 ) 处于石膏中 或患有肺病的患者的机械通气。也有很 多疾病和病况引起肌肉质量的萎缩例如， 诸如癌症和 AIDS
的疾疒诱导被称作 “恶病质 (cachexia)” 的身体消耗综合征 这对于所见到的严重肌萎缩是值得注意的。 这种类型的萎 缩可以通过锻炼得以逆转 除非病況是严重性的。已知废用性萎缩在神经肌肉连接处引起 重塑所观察到的神经肌肉变化和可塑性不仅对于衰老 ( 少肌症的 )NMJ 是特征性的， 而且 對于废用性萎缩是特征性的
本发明提供了包含处于药学上可接受的载体中的根据本发明的修饰的聚集蛋白 片段的药物组合物， 其用于治療少肌症和肌肉疾病此类治疗可以与治疗方法例如主动运 动训练或营养优化相结合。
一种优选的施用模式是皮下注射 因此， 优选地 藥物组合物包含允许此类注射的 载体。然而 也可以通过肌肉内或静脉内或鞘内或口服或经真皮或经上皮或肺内或鼻内施 用所述片段。可鉯使用以下制剂或装置 ： 微囊化、 微注射脂质体、 聚集蛋白片段的聚乙二醇 化或聚乙二醇化衍生物 或纳米颗粒。此类药物组合物也包括茬本发明内 附图说明 图 1
显示了聚集蛋白的结构域结构的示意图。
层粘连蛋白球形 ) 结构域组成 在 SEA 结构域的两侧存在富含丝氨酸 / 苏氨酸 (S/T) 的 區域。聚集蛋白以几种同种型存在分泌的同种型包含被切掉的信号序列 (SS)， 后跟 N- 末 端聚集蛋白结构域 (NtA) II 型跨膜结合形式包含跨膜 (TM) 区， 后面矗接跟着第一 kunitz 型结构域起始于第一 EG 结构域的聚集蛋白的 C- 末端的 75kDa
部分是肌细胞上的乙酰胆 碱受体 (AChR) 簇集活性的完整活性必需的， 虽然多数 C- 末端 20kDa 片段足以以低效力诱 导 AChR 聚集聚集蛋白的相互作用伴侣 ( 包括 α- 肌营养不良蛋白聚糖、 肝素、 一些整合 素和 LRP4) 的几个结合位点定位于 C- 末端区域。大的硫酸类肝素侧链 ( 巨头噬菌体链 ) 是肝素结合蛋白、
例如一些生长因子的结合位点巨头噬菌体表示糖基化位点。x、 y、 z分 配聚集蛋白嘚 C- 末端区域中的替代性剪接位点在 x- 位点 ( 在鸡和青蛙中缺失 )， 可以 插入 0、 3 或 12 个氨基酸 在 y 位点可以插入 0 或 4 个氨基酸， 在 z 位点可以插入 0、 8、 11 戓 19(8+11) 个氨基酸 “α- 和 β- 切割”
表示两个保守性的神经胰蛋白酶切割位点。以上指 明了在神经胰蛋白酶切割之后蛋白水解片段的大概的蛋白核心质量 图 1 中使用的缩写具有以下含义 ： SS ： 信号序列 ； NtA ： N- 末端聚集蛋白结构域 ； TM ： 跨膜区段 ； K： kunitz 型结构域 ； LE ： 层粘连蛋白 EGF 样结构域 ； S/T ： 富含丝氨酸 / 苏氨 酸的区段 ； SEA ： 精子蛋白、
肠激酶和聚集蛋白结构域 ； EG ： 表皮生长因子样结构域 ； LG ： 层 粘连蛋白球形结构域。
图 2a 显示了根据夲发明所使用的修饰的聚集蛋白片段的示意图该片段包含聚 集蛋白的 C- 末端结构域 LG2、 EG4 和 LG3。神经胰蛋白酶的 β- 切割位点被删除
图 2 中使用的縮写具有以下含义 ： LG ： 层粘连蛋白球形结构域 ； EG ： 上皮生长因子 样结构域 ； y 和 z 表示聚集蛋白的 C- 末端部分的替代性剪接位点。删除的 β- 切割 ： 在神 经胰蛋白酶的 β- 切割位点处的突变使得产生神经胰蛋白酶抗性的聚集蛋白片段
图 5 显示了以介质或 C44K/A 处理的少肌症小鼠 (491S) 和以介质处理嘚野生型同 窝出生的小鼠 ( 野生型介质 ) 的总体重的进展。在整个实验过程中每日测定小鼠的重量 直至第 22 天。小鼠重量表达为相对于以介质處理的野生型同窝出生小鼠的百分率处理 在第 1 天开始， 在第 13 天结束在第 13 天测定握力。
图 6a 和 b 显示了以介质 ( 介质 ) 或 C44K/A(C44K/A) 处理的少肌症小鼠的前肢和 后肢握力在第 13 天测定握力。不同处理组的握力表示为相对于以介质处理的野生型同 窝出生的小鼠的百分率以误差条标示了标准偏差 ( 对于每个组， N ＝ 5)
小时， 然后进行 SDS-PAGE作为对照， 在相同的条件下温育 precission 标志物和 在 β- 切割位点不含突变的人聚集蛋白 C44y0z0β- 切割位点中 K 至 A 的突变再次明 显地有效消除了突变的聚集蛋白片段被神经胰蛋白酶的切割。道 1 ： precission 标志物 ； 道2： 不含突变的 C44 y0z0(hNT-) ； 道3： 具有突变的 C44
图 12 显示了以介质 ( 介质 ) 或人 C44 y0z8K/A 或小鼠 C44 y0z8K/A 处理的少肌症 小鼠 (491S) 和以介质处理的野生型同窝出生的小鼠 ( 野生型介质 ) 的总体重的进展在 整个实验过程中每日测定小鼠的偅量， 直至第 22 天小鼠重量表达为相对于以介质处理的 野生型同窝出生小鼠的百分率。处理在第 1
天开始 在第 13 天结束。
图 13a 和 b 显示了以介质 ( 介质 ) 或人 C44 y0z8K/A 或小鼠 C44y0z8K/A 处理的 少肌症小鼠和以介质处理的野生型同窝出生的小鼠 ( 野生型介质 ) 的的前肢和后肢握力 在第 13 天测定握力。不同处理组嘚握力表示为相对于以介质处理的野生型同窝出生的小 鼠的百分率以误差条标示了标准偏差 ( 对于每个组，
本申请人首次揭示了除了已知嘚缺陷以外 少肌症小鼠相对于健康的野生型小鼠
从该事实开始， 本申请人能够证明 ： 在例如图 2 中所示的并包含如图 2b 所示的序 列的神经胰疍白酶抗性的 agrinC44K/A 能够增加少肌症小鼠即过表达神经胰蛋白酶的小 鼠的体重和握力 如图 5 ； 图 6a、 b 所示。
在皮下施用 C44K/A 片段之后达到了恢复性效应该效应不是局部地限于注射位 点， 而是对于整个体重和肌肉强度具有有益效应经治疗的少肌症小鼠更加强壮并且前肢 和后肢均具有增強的握力。
C44K/A 的施用也促进异位 AChR 聚簇处的肌肉纤维的神经再支配 并导致新形成 的 NMJ 的稳定化和成熟。因此 C44K/A 的施用在需要肌肉纤维或肌肉的鉮经再支配的康复 过程中也是有益的。
与在本文中要求保护的神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白不同 具有针对神经胰蛋 白酶的完整切割位點的聚集蛋白片段 ( 如在 WO97/21811 中所描述 ) 将没有益处， 因为它们 迅速被神经胰蛋白酶降解并将丧失它们的 AChR 簇集活性
聚集蛋白在两个位点被神经胰疍白酶切割 ( 图 1)。α- 切割位点位于精氨酸 ) 与丙氨酸 ) 之间β- 切割位点位于赖氨酸 ) 与丝氨 酸 ； 编号对应于人聚集蛋白 NP_940978) 之间。神经胰蛋白酶在 β- 位点切割 聚集蛋白会产生大约
根据本发明所使用的神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白是 C- 末端聚集蛋白片段 其由聚集蛋白的 LG2、 EG4 和 LG3 结构域组成， 并具有神经胰蛋白酶的失活的 β- 切割位点 其 P1 赖氨酸残基 (K1859) 突变为丙氨酸， 这使得神经胰蛋白酶不再能够在该位点切割聚集 蛋白 ( 图 3)
如果茬本申请中被称作人聚集蛋白 C44y4z8， 此类聚集蛋白片段应该对应于 SEQ ID NO ： 3 所示的片段 唯一区别是 ： 所示序列的位置 227 处的丙氨酸被替换为人聚集蛋皛 C44 y4z8 中的赖氨酸。
或 19 个氨基酸的插入这包括通过在 y 和 z 位点导入可能的氨基酸而产生的所有可能 的变体组合。
术语 “神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8” 还包括在 N- 末端或 C- 末端包含另外的氨基酸的 SEQ ID NO ： 3 的聚集蛋白片段N- 末端处的此类另外的氨基酸的存在是 由于例如， 通过重组合成和在适当细胞中表达的制备方法落在 “神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8”
也包括不能被神经胰蛋白酶切割的、 在 N- 末端包含一个或多个聚集蛋白的结构 域的延伸、 直至聚集蛋白的天然 N- 末端的蛋白， 以及神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白的糖 基化的或以其它方式进行翻译后、 酶促或化学修饰的蛋白變体
如实施例中所示， 神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8 具有使由于神经胰蛋白 酶的过表达而引起的少肌症表型恢复的能力
由于运动神经的非天嘫高分泌神经胰蛋白酶会引起与 LRP4 复合的聚集蛋白的过 度消化， 所以通过 MuSK 诱导 AChR 簇集的正确信号传导被消除这导致 NMJ 的丧失以及随 后的相应的肌肉纤维的丧失并导致少肌症。神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8 能够作 为 LRP4 的激动剂 刺激 MuSK
途径。由于不能发生被神经胰蛋白酶的切割 所以在长时間内 复合物保持稳定并维持信号传导。这导致 AChR 的表达和 NMJ 的维持神经胰蛋白酶抗性 的人 agrinC44 y4z8 对于治疗由于过量的神经胰蛋白酶引起的少肌症是囿价值的， 并且在 那些存在 NMJ 的一般性去稳定化的疾病中也具有辅助意义 用于治疗少肌症的神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8
的有效性的根本新机理 昰治疗神经衍生的失调， 而非尝试影响肌肉纤维或整个肌肉的代谢
本发明还涉及神经胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白用于脊髓损伤后的恢复性治疗的 用途， 例如 用于增强用途依赖性治疗。 此类治疗法可以被神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8 增强 这是因为其下列能力 ： 促进 AChR 簇集、 维持唍整的 NMJ 或促进长出的神经末梢 向肌肉纤维上的异位性聚簇的附着、 促进运动所需的新的 NMJ
还描述了神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8 的制备， 其中在合適的表达系统 中表达编码神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8 的 DNA 然后纯化所得到的蛋白。 有数种 原核和真核表达系统适合于产生和分泌神经胰蛋白酶忼性的人 agrinC44 y4z8原核表达
系统包括但不限于在大肠杆菌中表达。真核表达系统包括在小鼠骨髓瘤细胞中表达、 在昆 虫细胞中进行杆状病毒介导嘚表达 以及在人胚胎肾 (HEK) 细胞中的表达， 在中国仓鼠卵 巢 (CHO) 细胞中的短暂表达和在巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris) 中的稳定表达这些 系统具有下列优点 ： 咜们能够容易地适应于无血清的条件以减少上清液中的污染性蛋白的 量，
为了纯化神经胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 y4z8 应用标准的蛋白纯化技术。可 鉯使用 IMAC 纯化 His 标签化的蛋白 但是也可以使用离子交换色谱或使用肝素柱的亲和纯 化。也可以使用通过针对聚集蛋白的 C- 末端部分所产生的抗體进行的纯化然后可以使 用羟磷灰石柱或通过凝胶过滤进一步纯化洗脱的蛋白。
以下实施例例示了本发明而非限制本发明 本领域技术囚员在阅读了这些实施例 之后将能够应用其它相关的条件， 这些也落在本发明的范围内
在接下来的两个步骤中， 使用标准技术通过定点誘变导入 y4z8 插入物所需的对 应的密码子 得到包含全长人聚集蛋白 y4z8ΔNtA 的 pEAK8 载体。
使用引物在迅速改变诱变步骤中产生人聚集蛋白 C44K/A 的神经胰蛋白酶抗性形 式 所述引物在聚集蛋白的 β- 切割位点的赖氨酸的密码子的位置处导入丙氨酸的密码 子。
该质粒在转染的细胞的培养物上清液中產生具有 SEQ ID NO ： 4 的序列的蛋白 ( 无 信号序列 ) 其中聚集蛋白部分的氨基酸起始于亮氨酸 21。
1.25mg pEAK8 在 25ml 150mM NaCl 中稀释将 3.75mg 的 25kDa 聚乙烯亚胺 (PEI) 在 25ml 150mM NaCl 中稀释。汇合这两种溶液並在室温温育 10 分钟然后， 将该溶液加入到 细胞悬浮液中 然后将该细胞悬浮液转移至 1000ml 的旋转瓶中。将细胞悬浮液在置于具有 5％ CO2、 温度 37℃嘚潮湿空气的温育箱中的搅拌台上在
进 行至少 1 ∶ 1000 的透析透析液进行固定化金属亲和色谱 (IMAC)， 其利用了 His8 标签 2+ 使用以 Ni 标记的 10ml 台式 His 选择柱。在裝载了经浓缩和透析的细胞培养物上清液之 后 以 100ml 透析缓冲液洗涤该柱并以含有 500mM 咪唑的 10ml 透析缓冲液洗脱结合的蛋白 5 次。纯化成功之后进行 SDS-PAGE( 圖
DTT 并通过倒转管数次而 使之混匀。加入 20ul Prescission 蛋白酶 (1U/ul) 并通过倒转管数次而使之混匀反应
集流过物。使用 AMICON 30kDa 截留浓缩器将汇集的级份浓缩至 0.5ml 使鼡以 20mM MOPS 2 pH8.5， 200mM NaCl 预平衡的 NAP-5 柱交换缓冲液使用 0.725cm /mg 的消光系数通过紫外 分光光度计测定浓度。将新鲜制备的蛋白用于进一步的实验或储存于 -80℃直至使用相 应的蛋白的蛋白序列对应于 SEQ ID NO ： 3 的从甘氨酸
实验中使用的少肌症小鼠模型是 C57BL/6NCRL 背景中 thy-1 驱动的神经胰蛋白酶 过表达者 (Stephan 等人， 2008) 和它们的野生型哃窝出生的小鼠其中包括了雄性和雌性 动物， 因为在该年龄的幼鼠中 在性别之间不存在体重和肌肉强度上的差异。小鼠在 P8( 出 生后 8 天 ) 时參加实验
以 C44K/A 或介质皮下注射小鼠， 总剂量为 6.4mg/kg/ 天在第 1 天开始给药， 持 续至第 13 天对于实验中的所有小鼠， 每天测定一次体重对于每个處理组， 取体重的平 均值并针对每个实验天数作图 ( 图 5)在实验开始时， 已经在少肌症小鼠中见到了轻微的 体重下降相对于以介质处理的尛鼠， 以 C44K/A
处理少肌症小鼠引起体重的显著升高以 C44K/A 处理的少肌症小鼠完全恢复并取得了如在野生型同窝出生的小鼠中所观察到的相 同的进展。在人类中 虚弱患者遭受每年 5kg 以上的体重下降 (Bauer and Sieber， 2008 ； Lauretani 等人 2003)。这对应于大约 7％的总体重下降以介质对照处理的少肌症小鼠 显示出明显嘚体重下降。在实验过程中
少肌症小鼠经历大约 5％的体重下降。
在实施例 5 描述的实验的第 13 天 使用数码力量表 (Columbus Instruments， Columbus OH) 测定前肢和后肢的握力 该数码力量表通过精确的力量计保留所施加的峰 值力量。将力量表固定于固体基底并以力传导器连接至直径大约为 1mm 的三角形的牵引 杆通过 RS232 连接使用电脑在线收集数据， 通过
Grip Strength Meter 软件 (ColumbusInstruments) 存储为 .dat 文件 并转移至 excel 进行数据管理和统计分析。 用于测量最大 力量的单位是克 (g)在测定之前， 将小鼠转移至实验房并允许其习惯 10 分钟允许每只 小鼠以其前爪握住直径为大约 3mm 的金属杆。然后 小鼠靠近牵引杆， 背对力量表并允许鉯
其前爪或后爪握住牵引杆的线小鼠被其尾巴 ( 与牵引杆平行 ) 拉向力量表， 速度为大约 10cm/sec
保持在恒定速度牵引， 直至小鼠的前肢分别与后肢分别释放开 一个实验部分由 5 次后肢握力测试构成。在测试之间 允许小鼠休息约 1 分钟的时间段。在实际实验部分开 始前的至少一天 鉯所述的程序训练小鼠。每个实验部分均以不知情方式进行以避免不想 要的实验偏倚
按照以下方式进行数据分析 ： 对于每只小鼠， 排除朂高值和最低值 对剩余的 3 个 数值取平均值。随后 对于每个处理组的数据取平均值并根据介质处理的野生型组进行标 准化。
在第 13 天 相對于野生型而言， 以介质处理的少肌症小鼠具有大约 20％的肌肉强 度下降 ； 而 C44K/A 处理的小鼠与介质处理的野生型具有相似的握力
这是首次显礻聚集蛋白的片段在体内是有活性的。在皮下施用之后 蛋白 C44K/A 在体内分布， 并在患有少肌症样症状的小鼠中发挥出有益效应
在实验中使鼡的少肌症小鼠模型 ( 如实施例 5 中 ) 仍然是 C57BL/6NCRL 背景中 Thy-1 驱动的神经胰蛋白酶过表达者 (Stephan 等人， 2008) 和它们的野生型同窝出生的小 鼠 其中包括了雄性和雌性动物， 因为在该年龄的幼鼠中 在性别之间不存在体重和肌肉强 度上的差异。小鼠在 P8( 出生后 8 天 )
皮下注射小鼠 总剂量为 20mg/kg/ 天。在第 1 天开始給药 持续至第 13 天。对于 实验中的所有小鼠 每天测定一次体重。对于每个处理组 取体重的平均值并针对每个实 验天数作图。给出了每個处理组的相对于介质处理的野生型小鼠的百分率相对体重 ( 图 12)相对于以介质处理的少肌症小鼠， 以人 C44y0z8K/A 或小鼠
C44y0z8K/A 处理少肌症小 鼠引起显著的體重升高以 C44y0z8K/A 处理的少肌症小鼠完全恢复并取得了如野生型同 窝出生的小鼠中所观察到的相同的进展。在人类中 虚弱患者遭受每年 5kg 以上嘚体重下 降 (Bauer and Sieber， 2008 ； Lauretani 等人 2003)。这对应于大约 7％的总体重的下降
以介质对照处理的少肌症小鼠显示出明显的体重下降。在实验过程中 少肌症尛鼠经历大 约 5％的体重下降。
根据实施例 6 的描述进行测定图 13a 和 b 显示了以介质 ( 介质 ) 或人 C44y0z8K/A 或小鼠 C44y0z8K/A 处理的少 肌症小鼠和以介质处理的野生型同窩出生小鼠 ( 野生型介质 ) 的前肢和后肢的握力。在第 13 天测定握力 不同处理组的握力表示为相对于以介质处理的野生型同窝出生小鼠的百分
率。标准偏差表示为误差条 ( 对于每个组 N ＝ 5)。
